DNA納米技術在生物醫學上的應用

路亞瓊綜述，王晴凈審校

0 引 言

納米技術是在1～100 nm尺度范圍內的結構材料的基礎上，研究其性質和應用的技術。從20世紀80年代末逐步發展起來后，相繼和物理學、化學、生物技術有機結合。納米材料能夠表現出與宏觀物體相對獨立的運動規律和特殊的理化性質，因此可以構建具有特定功能的納米結構和器件來解決實際問題，在醫學領域有誘人的應用前景?，F介紹DNA納米結構在生物醫學領域上的三大應用，并對DNA納米技術的未來進行展望。

1 DNA 納米技術在醫學上的應用

1.1DNA納米技術在醫學檢測方面的應用DNA納米技術為發展單分子水平上的生物傳感器提供了新的思路，可作為生物分子探針載體平臺的空間可定位骨架。之前的臨床研究表明多種新生物標記物(如microRNA)的含量增加或減少可能導致多種疾病的發生，而且一種疾病往往與多個基因標記物有關。為實現超靈敏和個性化的疾病分子分析，新出現的DNA納米材料為推動超靈敏生物檢測領域的發展提供了新的應用方向。最早將DNA origami應用到生物檢測領域中的是Yan課題組，他們將尺寸為100 nm×70 nm的矩形折紙作為生物芯片來輔助檢測溶液中的RNA分子[1]。在折紙芯片特定位置的3列訂書釘鏈上伸出20個堿基長的寡核苷酸單鏈作為探針，分別可以和3種microRNA序列雜交，當和靶向RNA分子雜交后，DNA/RNA 雙鏈成為帶有位阻效應的V型結構，其硬度和高度的增加可通過AFM識別。Fan實驗室在“中國地圖”折紙的折紙芯片上，將剛性的“V型探針”改為更加簡便的“線性探針”，成功實現了對特定靶向DNA的檢測[2]。除了DNA折紙術構建的生物芯片外，DNA四面體可以在自組裝的四條DNA單鏈的頂點處伸出特定的寡核苷酸探針，實現對DNA、RNA的超靈敏檢測[3-4]。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNP)是最常見的一種人類可遺傳變異，同時可以作為疾病診斷的有效標記，所以對SNP的檢測區分一直備受關注?；贒NA折紙平臺，不僅可以實現SNP的區分，還能通過AFM進行可視化檢測。Seeman等[5]在矩形折紙芯片上，設計了可讀出的包含有A、T、C、G4個核苷酸字母的形狀，當單核苷酸錯配為T的靶向DNA存在時，無法和探針T完全互補，此時信號分子淬滅，該核苷酸形狀T消失，AFM圖像可直接讀出錯配結果。相比之前在均相和界面上的檢測方法，該平臺可實現多個SNP位點的可視化讀數[5]，在醫療診斷方面的應用性就可以大為加強[5]。

DNA納米結構尤其是DNA折紙可作為納米尺度的“液晶顯示屏”成為信號輸出設備，在AFM的成像幫助下，實現基因缺損與異常等疾病的高靈敏檢測和診斷。除此之外，還可偶聯其他分子如納米金、抗體、核酸適配體等實現對重金屬離子、相應蛋白或酶以及配體的檢測[6-7]。DNA納米結構因為其構型變化和某些金屬離子有關，可以檢測鉛、鎂、鋅、汞等多種元素。Mirkin等[8]將在2種納米金顆粒上分別修飾一條互補DNA鏈，其含有T-T錯配，當溶液中存在汞離子時，2條DNA鏈可形成穩定的T-Hg-T結構而脫離納米金，其表面失去DNA鏈的保護而聚集沉淀，實現對汞離子的檢測。Elezgaray實驗室則利用矩形折紙芯片實現對鉀離子的定量檢測。在折紙芯片上排布并伸出可以和G四聯體相連接的探針，當K+濃度很富集時，其結構不變，減少鉀離子濃度，則G四聯體構象發生變化，打開為單鏈進而引發DNA雜交反應，根據熒光變化檢測鉀離子濃度的改變[9]。

1.2DNA納米技術在醫學治療方面的應用DNA具有優越的易修飾性，與許多基團如氨基、巰基、羧基、特異的小分子和各種熒光基團等相整合[10-11]；作為具有良好生物相容性的三大生物大分子之一，安全無毒副作用。DNA納米結構具有多樣的編碼能力和良好的可設計性，載帶藥物量大，在體內走向明確；具有良好的滲透性，可傳送和定位傳遞信息，通過細胞表面配體的特異性可定位的在靶向位置緩釋藥物。這些都使得DNA納米結構具有優越的生物醫學應用[12-17]。

Fan課題組利用滾環擴增(rolling circle amplification，RCA)原理獲得一條長單鏈且具有多個重復單元，以此代替噬菌體單鏈M13mp18作為腳手架鏈，訂書釘鏈的數目降低為3條，即可折疊出DNA納米帶結構，合成方便且大大節約了實驗成本。在staple鏈上攜載免疫核酸CpG序列，進入細胞，細胞攝取能力更為高效，免疫活性較之含有CpG序列的單、雙鏈DNA增幅很大[18]。Weizmann課題組利用相似的設計自組裝為DNA納米帶結構，載帶小分子干擾RNA沉默特定基因，同時還可作為細胞中的pH報告器[19]。Ding課題組發現DNA納米結構具有增強的腫瘤被動靶向性和在腫瘤區域的長滯留效應，他們將抗癌藥物阿霉素(doxorubicin)以嵌入的形式載帶在三角形DNA折紙內，使其具有大劑量的藥物載帶和持久的緩慢釋放性，展現了DNA折紙在藥物載帶方面突出的治療功效[20-21]。

除了靜態的DNA納米結構可以在藥物運輸、靶向治療上發揮傳統方式難以匹敵的療效外，可根據需要靈活設計開關狀態的動態DNA納米機器更適合于生物治療領域。Yan課題組設計了一個以核酸適配體為開關的六邊形圓筒結構，當細胞表面的抗原存在時，可與核酸適配體發生高親和作用結合，將六邊形折紙結構解鎖打開，釋放空腔內的載帶物[22]。Church課題組則設計了三維的六棱桶狀納米結構，通過細胞膜表面上2個不同受體相對應的核酸適體的構象變化人為控制開關，當DNA六棱桶進入細胞后，當且僅當2個目標受體都存在時，六棱桶才能打開，通過此途徑提高納米結構的選擇性，進行對靶標癌細胞的特異性識別，桶內載帶的抗體緩釋，從而抑制癌細胞的生長[23]。DNA納米結構載體具有良好的體內穩定性和較強的腫瘤靶向性，在醫學治療中具有廣闊的應用前景。

1.3DNA納米技術在醫學仿生方面的應用人類的生物系統是復雜且精密的，為了對它的運轉方式有更好的了解，科研工作者利用DNA納米技術構造生物仿生系統。首先從較基礎的生物分子機器開始構建。DNA和蛋白質的關系水乳交融，連接方式多種多樣，如特殊的DNA序列可以識別鋅指蛋白并連接[24]；修飾有Ni-NTA的DNA分子可以與帶有組氨酸標簽的蛋白相結合連接[25]；修飾有生物素的DNA可以和鏈霉親和素通過抗體作用相連接[26]；DNA和多肽可通過EDC/NHS反應相連接等[27]。其中，生物素和鏈霉親和素因其高親和力的牢固結合而被廣泛應用開發。Yan等[28]在DNA二維網格結構上設計了若干條修飾有生物素的DNA鏈，實現了鏈霉親和素蛋白陣列。Kuzyk課題組在矩形DNA折紙上，排布鏈霉親和素的圖形[34]。核酸適配體(aptamer)和蛋白相互作用中的距離效應也是構建生物仿生系統的研究范圍。Yan課題組將分別和凝血酶2個區域結合的apt-A和apt-B作為研究對象，利用DNA納米結構的可尋址性精確的控制兩者之間的間距，進而操縱其與凝血酶相結合的能力[29]。這篇報道是基于DNA納米結構來人工模擬并控制生物大分子相互作用的首例。

Turberfield課題組設計了具有空腔的DNA納米籠，在特定位置的DNA鏈上修飾tris-NTA，將帶有組氨酸標簽(His-tag)的蛋白錨定于其上，并與冷凍電子顯微鏡技術相結合獲得目標蛋白質分子的高分辨率圖像并解析結構，為生物結構學家夢寐以求的研究提供了新的思路[30]。Fan課題組利用DNA納米技術人工模擬了生物體內常見的雙酶體系。在矩形DNA折紙上組裝葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶，在折紙上控制兩個酶之間的距離，并觀察酶聯反應的變化，發現兩者之間呈反比；之后將矩形折紙的上下兩端封閉得到DNA納米圓筒并作為雙酶級聯生物反應器，與矩形折紙相比，同樣距離下酶聯級促的反應活性更高，猜測是“三維限域空間”效應導致[31]。自然界中存在微管上向負端“行走”的動力蛋白和向正端“行走”的驅動蛋白(Kinesin-1)來運輸細胞內的“貨物”，Peterson課題組構建了三維的螺旋管結構作為它們運輸的“貨物”，通過控制這2種馬達蛋白的極性、數目、位置來研究它們的運輸特征[32]。

研究膜結構和動力學的必須工具是人工脂質雙分子層，合成理化性質穩定，尺寸可控的脂質囊泡具有很大的意義，可用于膜蛋白解析，藥物遞送等過程，應用廣泛。Shih課題組設計尺寸不一的三維DNA納米環形結構作為脂質體生長的模版，合成直徑<100 nm且形貌均一的立體囊泡結構[33]。Sugiyama課題組將人工磷脂雙分子層作為可變化的基底，在其上鋪上十字形狀的DNA折紙來輔助構建晶格狀大分子[34]。

生物體的磷脂雙分子層中的納米孔通道從本質上來說是一種離子通道，這種跨膜通道可以調控離子或其他小生物分子的運輸，利用DNA納米技術來構建納米孔材料是醫學仿生領域內有價值的內容。Simmel課題組構建了一端為桿狀一端為桶形“蓋子”的結構，主干桿狀結構可嵌入磷脂雙分子層，蓋狀結構將主干固定于膜上不動。通過單通道電生理學實驗設備，對這種復合型納米孔通道進行電導表征，發現它們與生命中天然存在的通道相似；當DNA鏈穿過通道時，每種核酸分子的電信號特征都不相同，可鑒定不同的DNA分子[35]。除此之外，DNA納米結構孔結構也模擬生物仿生系統檢測各種生物分子[36-43]。

DNA納米結構可以模擬酶聯級促反應器和納米孔通道外，還可與病毒衣殼相結合進入細胞以增強細胞傳送力，構建宏觀材料水凝膠作為三維細胞培養的門控等多種用途。

2 展 望

在多學科相互聯系交叉發展的21世紀，DNA納米技術因其具有尋址性的結構信息，強大的分子載帶量和良好的生物兼容性站在了發展的前沿。DNA納米結構從簡單的幾條DNA鏈自組裝的tile結構發展到立體復雜的DNA折紙圖案，從間接的凝膠表征到可視化的照片顯示，從靜態的圖形圖案到動態的分子機器，DNA納米結構越來越復雜，元件越來越精細。

DNA納米技術的快速發展，帶來了在生物、化學、醫學等領域巨大的應用潛力，在生物醫學上的研究方向是向智能化進行的，由于精確的可定制性，DNA納米結構，可對各種病原微生物、腫瘤標志物、基因變異等各種疾病的相關指標進行早期診斷和靈敏度高的檢測，先進的診斷方式至關重要；研究并制備載帶有特異性藥物的納米結構載體，在靶向部位定時定量的緩釋藥物，以解決癌癥的可轉移性或治療其他重大疾??；將納米機器努力做得像天然生命系統一樣，按照人類的指令精確可控的完成各種任務和研究，這是其他技術在醫學仿生領域所不具備的優勢。

雖然DNA納米技術發展很快，但仍處于發展的初期階段，面臨諸多挑戰，如DNA合成的高成本、更高級結構的設計、體內的安全性評估、細胞的攝取效率等。相信隨著科學的發展，DNA納米技術從實驗室走向臨床實踐的道路艱辛卻光明。

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