量熱分析化學放大方法及技術

鄭藝華

(青島大學 機電工程學院 生物系統熱科學研究室，山東 青島 266071)

量熱分析方法[1]通過測量各種熱變化探索和建立內部反應現象、機理和規律，是進行反應熱動力學研究，以及進行分析檢測的主要方法和手段。比較而言，量熱分析方法通用性強，不受光學及電化學等屬性的干擾，滿足實際試樣的要求。

目前，各種類型的商用量熱儀靈敏度和分辨率已達到微納瓦級別，但價格昂貴、環境要求苛刻，主要在實驗室進行理論分析和熱力學、動力學研究。而在應用方面，以量熱式生物傳感器為代表的量熱分析系統能準確而快速地進行分析測試[2-5]，通過結合微流控分析和借助微納米加工技術構建微納米系統[6-7]是其重要的創新方向和潛在發展領域。

熱信號是表觀、宏觀量，量熱方法應用在痕量分析的特異性和靈敏度往往不盡如人意。一般地，其特異性可通過參比[8]并結合特定的生物敏感元件(酶、細胞等)來實現，但如果反應過程的熱量變化很小，如α-糜蛋白酶催化ATEE水解的反應焓變僅為-1.1 kJ/mol，測量將非常困難，簡單通過增大熱傳感器靈敏度[9]并結合預測算法[10]來提升靈敏度的方法有限，并不能提高信噪比。采用化學放大方法是一種有效途徑，但僅從加大濃度等方面來考慮會增大系統比熱，易造成沉淀，影響反應進程，通過富集減少樣品量，降低檢出限，進一步利用質子化反應和級聯反應等手段增大反應熱焓是最佳方案，靈敏度和選擇性能的提高適用于分析檢測定量化和小樣化的發展趨勢。

1 富 集

富集是分析預處理的必要步驟，是排除干擾、降低檢出限、提高分析精度的重要手段，目前離線富集方式需手工操作，繁瑣、耗時長，同時增加檢測的復雜性和不確定性，也增加了誤差傳遞過程。流動注射技術[11]的在線分離富集功能克服了手動操作的缺陷，使重現性和準確度顯著提高。但仍需利用洗脫液，并且分離、富集和洗脫各步驟獨立，流程和流路復雜，易干擾，效果受洗脫液性質制約。固相光度法自被Yoshimura等[12]提出以來，已廣泛應用于各分析檢測領域[13]，該法集分離、富集、測試于一體，分析檢測直接在固體基質表面進行，但由于采用可見光、紫外、熒光和光譜測試等光度方法，固相載體的透射或反射等光學性能限制了自身的選擇范圍及固相光度法的應用。

圖1 富集、檢測一體化量熱式生物傳感器系統原理圖[17]Fig.1 Schematic diagram of the calorimetric biosensor with integrated of concentration and detection[17]1.six-way valve;2.sixteen-way valve;3.peristaltic pump;4.thermostat;5.injection valve;6.thermopile;7.reaction cell;8.reference cell;9.data acquisition module

通過相關基礎微量熱分析研究[14-15]，集成富集的量熱分析方法可同時實現復雜樣品基體分離和目標組分富集，提高有效信號強度，并改善其特異性，滿足對微量組分分析檢測的需求。富集、檢測一體化量熱式生物傳感器[16]省略了傳統的洗脫等步驟，實現了在線分離、富集、反應、檢測一體化，方法簡單、快速、樣品消耗量少，可實現自動化操作。如圖1所示系統[17]用以測試重金屬污染，反應室和參比室內填充富集載體，先富集樣液的重金屬，然后通入脲酶進行抑制，最后注入底物并在富集載體上發生酶反應，進行量熱測定，有無重金屬抑制條件下，脲酶活性發生變化，反映了重金屬對脲酶反應的影響，進而得到重金屬濃度，在0.002～0.01 mol/L濃度范圍內，抑制率與銅離子的初始濃度接近線性關系，檢出限為0.001 mol/L。

2 緩沖液放大

“緩沖液放大”是化學放大方法中最簡單、最常用的方法，即利用緩沖溶液的質子化反應焓變實現熱焓放大。假設存在反應(1)，其過程中釋放出n個質子。

X→Y+nH+;ΔHX,Y

(1)

當反應發生在緩沖液體系中，釋放的質子會被對應的共軛堿捕捉并結合，同時伴隨著質子焓變。

A-+H+→AH;ΔHr

(2)

那么反應過程總的焓變應為：

ΔHTotal=ΔHX,Y+ΔHr

(3)

所以，即使反應焓變很小，只要反應產生的質子被緩沖液捕獲，發生并發質子化反應同時放出熱量，反應焓變與質子化反應焓變共同作用仍會得到理想的反應焓變。如α-糜蛋白酶水解ATEE的反應在使用Tris緩沖液后，由于質子化放大作用，反應過程焓變由-1.1 kJ/mol增加為- 47.5 kJ/mol，熱信號測量將非常容易。然而，質子化反應也可能帶來問題，高質子化焓變緩沖液的使用可能產生相反的效應。例如，對于乳酸脫氫酶催化乳酸到丙酮酸，使用Tris緩沖液，測得的反應焓為-15.3 kJ/mol，如果使用磷酸鹽緩沖液，測得的反應焓為- 47.3 kJ/mol[18]。故進行量熱分析時，不一定選擇高質子化焓變緩沖液，而需選擇合適緩沖液種類。

基于反應設計和分析的需要，眾多學者對質子化反應及焓變進行研究。在缺乏精密量熱手段的時代，Bernhard等[19]通過文獻值理論計算得到了Tris和磷酸鹽緩沖液的質子化反應常數和熱焓值；Roig等[20]量熱分析了生物學研究常用的緩沖液(HEPES、PIPES、HEPPS、BES)，并得到了不同溫度狀態下各緩沖液的質子化反應焓變；Jumean團隊[21-25]對生化應用混合溶劑環境下的多種緩沖液(BES、TES、TABS、TAPS、TAPSO、MOPS、MOBS、MOPSO等) 的質子化反應及焓變進行了系列微量熱研究。表1列出了20種常用緩沖液的質子化反應焓。

表1 不同緩沖液的質子化反應焓[26]Table 1 The protonation reaction enthalpy of different buffers[26]

圖2 緩沖液體系的影響Fig.2 Influence of the buffer system

不同緩沖液在不同體系和不同催化反應過程的質子化反應和作用機理[27-31]可以應用到各量熱分析領域。如膽堿酯酶抑制法是有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留檢測的標準方法，但膽堿酯酶反應水解熱較低，故普遍利用了磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液進行熱放大。Morgan等[32]使用磷酸鹽緩沖液和固定化丁酰膽堿脂酶，利用酶熱敏電阻實現了對水中有機磷和氨基甲酸酯農藥的自動化連續監測，得到了不同農藥種類與濃度和酶半衰期的時間關系；Mattiasson等[33]使用分流式酶熱敏電阻，利用Tris緩沖液的質子化放大作用，分別采用農藥水解酶和酶抑制方法對不同種類的有機磷農藥進行了測定，檢出限分別達10 mg/L和 1 mg/L；此外，脲酶抑制方法檢測重金屬具有優勢，脲酶反應本身有理想的水解熱值，通過緩沖液放大后可以達到60 kJ/mol[34]。如表2所示，不同緩沖液和pH值對脲酶水解反應焓變存在直接的影響，借助反應熱變化得到的酶反應初速度來表示脲酶的活性，選擇合適的緩沖液可以定量分析重金屬離子 Cd2+、As3+、Zn2+，并可通過不同靈敏度實現特定重金屬離子的鑒別[38-39]，結果如圖2所示。文獻[40]也利用緩沖液放大研究了重金屬離子的抑制作用，圖3給出了citrate、acetate、tris-maleate 3種緩沖液下脲酶對重金屬離子Cu2+、Hg2+抑制率的變化。由此可見，緩沖液熱放大的研究結果對利用量熱方法進行農藥、重金屬污染定量和半定量的快速分析具有較大的實用價值。

SolventCp(J·mL-1·K-1)RelativesensitivityAceticacid2 161 93Acetone1 702 46Benzene1 532 73Carbondisulphide1 622 58Carbontetrachloride1 363 07Chloroform1 442 901，4?Dichlorobenzene1 213 46Diethylether1 652 53Ethanol1 962 13Ethylacetate1 742 40n?Hexane1 492 80Methanol2 022 07Toluene1 562 68Water4 181 00

3 非水溶液體系

非水媒介反應在生物、化學和醫學技術中的應用加強并擴展了對非水媒介反應特性的深入研究，目前量熱分析[41-42]研究涉及各種有機溶劑組成的非水溶液體系(表3)，并應用于膽固醇、過氧化物、甘油三脂和青霉素等的分析測量研究[43-47]。研究表明，由于較低的熱容(數據見表3)，非水溶液體系的量熱靈敏度高于水溶液體系，緩沖液水溶液中存在適量的有機溶劑能使量熱信號倍增。根據量熱分析，通過溶劑氫鍵網格的影響，水的存在狀態會極大地影響非水溶液體系以及緩沖液質子化反應的焓變[48-49]。

4 級聯反應放大

級聯反應放大是化學放大中最直接有效的方法，能提高有效信號強度，增大信噪比，降低檢出限。早在1853年，Friedrich Mohr利用氯水氧化放大碘化物，能得到6倍的最初的量，后人采用次氯酸鹽、溴水等氧化劑替代氯水深入研究了這種直接化學放大方法[50]。目前已出現組合酶放大[51]、聚合酶鏈式反應[52](PCR) 等技術，并廣泛應用在檢測、分析等領域。

利用酶的組合，可通過連續的酶反應來提高反應焓變，先前的產物可被連續地催化，最終得到的是焓變總和。如使用葡萄糖氧化酶(GOD)來測定葡萄糖[53-54]，存在以下反應：

(4)

如果同時包含過氧化氫酶(Catalase,CAT)，那么：

(5)

過氧化氫酶水解過氧化氫的熱焓約為87 kJ/mol，反應總焓變有效提升，同時被葡萄糖消耗的氧可通過H2O2的分解部分再生，降低了H2O2的危害，并可增加線性范圍。底物濃度較低時，尤其有效。級聯反應(4)～(5)也用于纖維二糖水解酶水解纖維二糖的反應動力學熱分析研究中，因纖維二糖水解酶水解纖維二糖的產物為葡萄糖，繼續應用反應式(4)～(5)，進行反應熱焓放大，能夠將其值從2.5 kJ/mol放大到360 kJ/mol，解決單獨纖維二糖水解酶水解反應熱量小，難以進行熱分析研究的問題[55]。

圖4 乳酸氧化酶、乳酸脫氫酶和過氧化氫酶的放大系統[56]Fig.4 Amplification system composed by LDH,LOD and CAT[56]

另一種級聯反應放大的方式是底物或副酶循環再生使用，通過預置副酶柱或同時固定多種酶來實現，可以提高靈敏度上千倍。Scheller等[56]采用此方法測定丙酮酸和乳酸，檢出限達10 nmol/L，焓變高達-225 kJ/mol。它同時利用了乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase,LDH)、乳酸氧化酶(Lactate oxidase,LOD)和過氧化氫酶，存在連鎖反應(圖4)。反應中乳酸被乳酸氧化酶氧化為丙酮酸(Pyruvate)，然后丙酮酸被乳酸脫氫酶脫氫為乳酸(L-Lactate)，周而復始，形成循環放大。同時，存在連續的過氧化氫酶的氧化反應，也放大了反應焓變。

農藥殘留和重金屬污染等在環境中的存在濃度低，且狀態和形式多樣，若在現場對實際試樣進行快速靈敏檢測，除利用緩沖液對膽堿酯酶水解反應進行熱放大外，采用酶級聯反應也是有效手段。Bhand等[57]對熱敏電阻裝置進行了改進，增加了預置酶柱，其中放置乙酰膽堿酯酶(Acetylcholin esterase，AChE)，AChE被農藥抑制，產物膽堿的量減少并與被抑制的程度成正比，進一步地，膽堿的量可通過膽堿氧化酶(Choline oxidase，CHOD)和過氧化氫酶的級聯反應熱量得到，該檢測利用了乙酰膽堿酯酶、膽堿氧化酶和過氧化氫酶的級聯反應，其靈敏度較高，檢測限為20～150 μg/L，其原理為反應式(6)～(8)。

(6)

(7)

(8)

Xu等[58]提供了相對廉價的農藥殘留量熱分析解決方案，利用動植物體提取的替代酯酶和酚氧化酶完成級聯酶反應，并通過離子交換法固定在樹脂上，進行檢測時，替代酯酶被農藥抑制，然后利用酚氧化酶催化替代酯酶反應的產物酚類物質，反應熱量變化增大了33倍，增強了熱分析的靈敏度和性能。

Zheng等[59]將化學熱放大原理應用于重金屬檢測，使用由醇氧化酶(Alcohol oxidase)和過氧化氫酶組成的固定化酶實現級聯反應，醇氧化酶被重金屬汞競爭性抑制，過氧化氫酶能催化醇氧化酶的水解產物——過氧化氫，通過級聯反應，提升反應總熱焓，大大提高檢測靈敏度和分辨率。

5 總結與展望

化學放大方法和技術是突破量熱分析方法選擇性和靈敏度限制，提升其性能的根本有效手段和途徑。量熱分析方法可通過富集、緩沖液放大、非水溶液體系、級聯反應等化學放大方法和手段從根本上提高量熱分析的選擇性、靈敏度和分析性能。上述熱放大手段的使用可使一些測試的檢測限從ppm級達到ppb級。

結合化學放大的量熱分析方法能提供兼顧速度、靈敏度和準確性分析檢測的有效方案和途徑，尤其適合現場和快速痕量分析檢測應用，以量熱式生物傳感器為代表的量熱分析系統已應用于農藥殘留、重金屬污染和安全分析監測等領域，借助于化學放大技術，量熱分析方法將具備更廣闊的應用前景。

參考文獻：

[1] Peter J H.PrinciplesofThermalAnalysisandCalorimetry.Royal Society of Chemistry(Great Britain),Cambridge,2002.

[2] Bataillard P.TrACTrendsinAnal.Chem.,1993,12(10):387-394.

[3] Zheng Y H,Ma Y Z,Nie Z G,Yang Q R.JournalofSafetyandEnvironment(鄭藝華，馬永志，聶兆廣，楊啟容.安全與環境學報),2010,5(10):65-99.

[4] Zheng Y H,Hua T C,Sun D W,Xiao J J,Xu F.J.FoodEng.,2006,74:24-29.

[5] Yakovlevaa M,Bhandb S,Danielsson B.Anal.Chim.Acta,2013,766(5):1-12.

[6] Wang L,Sipe D M,Xu Y,Lin Q.JournalofMicroelectromechanicalSystems,2008,17(2):318-326.

[7] Lee W,Lee J,Koh J.NanobiosensorsinDiseaseDiagnosis,2012,1:17-29.

[8] Mattiasson B,Danielsson B，Mosbach K.Anal.Lett.,1976,9(10):867-889.

[9] Yoon J Y.Chapter4:TemperatureSensors,in:IntroductiontoBiosensors.New York：Springer,2013.

[10] Wang L Y,Zheng Y H.InstrumentTechniqueandSensor(王麗影，鄭藝華.儀表技術與傳感器),2013,2:1-3.

[11] Fang Z L.FlowInjectionSeparationandPreconcentration.New York：Wiley VCH,1993.

[12] Yoshimura K,Waki H,Ohashi S.Talanta,1976,23(6):449-454.

[13] Rocha F R P,Raimundo I M,Teixeira L S G.Anal.Lett.,2011,44(1/3):528-559.

[14] Wang L P,Xu Y,Zheng Y H,Li D X,Xu F.Chem.J.Chin.Univ.(王麗萍，胥義，鄭藝華，李代禧，徐斐.高等學?；瘜W學報),2012,33(8):1771-1776.

[15] Wang L P,Xu Y,Zheng Y H.Chem.J.Chin.Univ.(王麗萍，胥義，鄭藝華.高等學?；瘜W學報),2012,33(12):2638-2643.

[16] Zheng Y H,Liu J,Ma Y Z.Qingdao University.China Patent(鄭藝華，劉君，馬永志.青島大學.中國專利),200910126677.9,2009-03-06.

[17] Zheng Y H,Liu X L,Ma Y Z,Xu Y,Xu F.Chin.J.Sci.Instrum.(鄭藝華，劉曉林，馬永志，胥義，徐斐.儀器儀表學報),2011,32(12):45-51.

[18] Rehak N N,Young D S.Clin.Chem.,1978,24:1414-1419.

[19] Bernhard S A.J.Biolog.Chem.,1956,218:961-969.

[20] Roig T,Baeckman P,Olofsson G.ActaChem.Scand.,1993,47:899-901.

[21] Bulos B N,Jumean F H.Thermochim.Acta,2004,411:91-94.

[22] Jumean F H,Abdo N M.Thermochim.Acta,2006,447:112-114.

[23] Jumean F H,Abdo N M.Thermochim.Acta,2006,448:44-46.

[24] Jumean F H,Abdo N M,Khamis M I.Thermochim.Acta,2008,475:22-24.

[25] Jumean F H,Abdo N M,Khamis M I.Thermochim.Acta,2011,524(1/2):194-196.

[26] Grime J K.AnalyticalSolutionCalorimetry.New York:Wiley-Interscience,1985.

[27] Sirotkin V A,Huettl R,Wolf G.Thermochim.Acta,2005,426:1-6.

[28] Bianconi M L.J.Biolog.Chem.,2003,278(21):18709-18713.

[29] Emilia O S,Carmen B,Luis G F.FEBSLetters,1998,435:219-224.

[30] Fukada H,Takahashi K.Proteins,1998,33:159-166.

[31] Wyrzykowski D,Pilarski B,Jacewicz D,Chmurzyn L.J.Therm.Anal.Calorim.,2013,111:1829-1836.

[32] Morgan W S G,Kuhn P C,Van N P P.WaterSci.Technol.,1985,17:855-865.

[33] Mattiasson B,Rieke E,Munnecke G.JournalofSolid-PhaseBiochemistry,1979,4(4):263-270.

[35] Hüttl R,Bohmhammel K,Wolf G,Oehmgen R.Thermochim.Acta,1995,250(1):1-12.

[36] Jespersen N D.J.Am.Chem.Soc.,1975,97(7):1662-1667.

[37] Schmidt H L,Krisam G,Grenner G.BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-Enzymology,1976,429(1):283-290.

[38] Oehlschl?ger K,Hüttl R,Wolf G.Thermochim.Acta,1996,271(10):41-48.

[39] Katrin O,Hüttl R,Wolf G.Thermochim.Acta,1998,310:185-189.

[40] Claudia P.Microchim.Acta,1999,130:209-214 .

[41] Flygare L,Danielsson B.Ann.NYAcad.Sci.,1988,542:485-496.

[42] Ramanathan K,Jonsson B R,Danielsson B.AnalysisinNon-aqueousMilieuUsingThermistors.In:Gupta,M.N.(Ed.),MethodsandToolsinBiosciencesandMedicine.MethodsinNon-AqueousEnzymology.BirkhauserVerlag,Basel,Switzerland,2000.

[43] Ramanathan K,Jonsson B R,Danielsson B.Anal.Chem.,2000,72:3443-3448.

[44] Danielsson B,Flygare L.Anal.Lett.,1989,22(6)：1417-1428.

[45] Danielsson B,Flygare L.Sens.ActuatorsB:Chemical,1990,1(1/6):523-527.

[46] Hundeck H G,Wei M,Scheper T,Schubert F.Biosens.Bioelectron.,1993,8(3/4):205-208.

[47] Raghavan V,Ramanathan K,Sundaram P V,Danielsson B.Clin.Chim.Acta,1999,289:145-158.

[48] Goldberg R N,Kishore N,Lennon R M.J.Phys.Chem.Ref.Data,2001,30:1-13.

[49] Sirotkin V A,Hüttl R,Wolf G.J.Therm.Anal.Calorim.,2008,93(2):515-520.

[50] Rajagopalan S R.Bull.Mater.Sci.,1983,5(3/4):317-322.

[51] Hansen E H,N?rgaard L,Pedersen M.Talanta,1994,38(3):275-282.

[52] Kopp M U,Mello A J,Manz A.Science,1998,280(5366):1046-1048.

[53] Satoh I.Sens.ActuatorsB,1994,5(1/4):245-247.

[54] Salman S,Soundararajana S,Safina G,Satoh I,Danielsson B.Talanta,2008,77(2):490-493.

[55] Murphy L,Baumann M J,Borch K,Sweeney M,Westh P.Anal.Biochem.,2010,404:140-148.

[56] Scheller F,Siegbahn N ,Danielsson B.Anal.Chem.,1985,57:1740-1744.

[57] Bhand S,Werntoft K,Berg V,H?gberg N,Sundaram P V,Danielsson B.ProceedingsofEighthWorldCongressonBiosensors,Granada Spain，2004.

[58] Xu F,Jiang M,Xu Y,Hua Z Z,Ma T H.Shanghai University of Science and Technology.ChinaPatent(徐斐，姜覓，胥義，華澤釗，馬天畫.上海理工大學.中國專利),200610147245.2,2006-12-14.

[59] Zheng Y H,Liu J,Ma Y Z.Qingdao University.China Patent(鄭藝華，劉君，馬永志.青島大學.中國專利)，201110150133.3,2011-05-25.