人工發酵劑混合發酵對香腸安全品質指標變化的影響

李 佳，劉忠義 ，陳 虞 ，羅鑫坪，楊 慧 ，李 平

（1.湘潭大學化工學院，湖南湘潭 411105；2.廣西高校北部灣特色海產品資源開發與高值化利用重點實驗室（欽州學院），廣西欽州 535000）

現在國家出臺各種安全標準和安全體系（如HACCP）用于監督食品行業的食品安全問題，但每年依然有許多關于食物中毒和食源性疾病散發的報道，發展新技術來控制食品中有害菌的生長是解決這些問題的方法之一。發酵香腸是將絞碎的肉加入一定比例腌制劑，經腌制和發酵后，得到成熟的、具有獨特風味的高營養肉制品。我國發酵肉制品歷史悠久，傳統自然發酵香腸的微生物主要來源于原材料及加工環境，這種情況下的微生物種類復雜不一，除了所需的有益于香腸發酵的微生物以外，還有很多是產生有害作用的雜菌，這導致產品品質不穩定，易引發腐敗變質且貨架期不長[1]。

亞硝酸鹽是肉制品加工業中廣泛使用的防腐劑，它的來源受環境的影響，主要有溫度、空氣、日光、微生物等，現實加工過程中主要來源于人工添加，在人體內日益富集的亞硝酸鹽會引起食物中毒甚至對人體有致癌危害[2]。因此，在不影響發色、風味情況下，尋找一種不添加亞硝酸鹽且風味與安全性俱佳的方法至關重要。有研究表明，經過人工馴化的乳酸菌產生的乳酸菌菌素能降解亞硝酸鹽，從而阻止亞硝胺的生成，提高產品的安全性[3]。還有關于混合菌種在魚肉制品安全性的研究報道，證實混合菌種發酵有利于保證和改善發酵魚肉的衛生品質，混合菌種主要由乳酸菌和酵母組成，并驗證了這些菌種的組成比例[4-7]。然而，這些研究很少涉及接種發酵對肉制品亞硝酸鹽含量及水分活度的影響，同時所用菌種都是實驗室擴大培養，而現在生產上大量使用直用型菌種，所以也有必要研究直用型菌種對香腸等肉制品的安全品質的影響。

在前期的研究中，依據文獻報道和試驗，驗證了在香腸中添加質量分數0.08%（W/W）乳酸菌和質量分數0.04%酵母進行混合發酵，可以得到風味品質俱佳的發酵香腸?；谌樗峋谏a安全優質食品中所起重要作用的生物學機理，研究混合菌種對香腸安全性的影響，以期利用混合菌種發酵加強其安全性和延長其貯藏期。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

（1）原料。新鮮豬肉，湘潭大學購物中心提供，屠宰后1～3 h，于-2～4℃條件下冷藏的新鮮豬前腿肉；腌制劑包括食鹽、味精、胡椒粉、姜粉、五香粉、白砂糖、紅曲粉、磷酸鹽、醬油、黃酒，均由湘潭大學購物中心提供；乳酸菌發酵劑，由北京川秀科技有限公司提供；酵母，安琪酵母股份有限公司提供；腸衣，譚氏百盛電子商務有限公司提供。

（2）試劑。組胺、腐胺、酪胺、精胺、亞精胺標準品，Sigma化學試劑公司提供；1,7-二氨基庚烷、丹衡酰氯，Applichen公司提供；醋酸銨、甲醇、丙酮、乙腈，為色譜純，西隴科學股份有限公司提供；亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司提供；MRS培養基、PCA培養基、孟加拉紅培養基、VRBA、BGLB肉湯，生化試劑，上海盛思生化科技有限公司提供。

（3）儀器。PTX-FA-110型電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司產品；PHS-3BW型數顯酸度計，上海般特儀器制造有限公司產品；Cary60型紫外分光光度計，安捷倫科技有限公司產品；HH-4型恒溫水浴鍋，上海申生科技有限公司產品；半微量定氮器，上海昕滬實驗設備有限公司產品；酸式滴定管，銘泰科教儀器設備有限公司產品；LC-20A型高效液相色譜，日本島津公司產品；TG18G型高速臺式離心機，湖南凱達科學儀器公司產品；FN 101-2型電熱鼓風干燥箱，長沙儀器儀表廠產品；YXQ-SG46-280S型手提式滅菌鍋，上海醫用儀器有限公司產品；SCW-CJ-1F型垂直流潔凈工作臺，蘇州市長春電子儀器廠產品；SPX-250B-D型恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠產品。

1.2 試驗方法

試驗過程中發現12 h以后感官上味道已經太酸，并且微生物表現出大量增長的趨勢，所以分析時間選擇在12 h以內。

1.2.1 發酵香腸的制備工藝

根據香腸基本配方略作修改[8]，主要操作如下：①絞肉：新鮮豬肉分肥、瘦肉清洗干凈后，分別絞碎成肉糜；②腌制劑：2.0%食鹽（以肉總量百分比計）、0.2%味精、0.3%胡椒粉、0.2%姜粉、0.2%五香粉、2.4%白砂糖、0.1%紅曲粉、0.1%磷酸鹽、0.8%醬油、2.4%黃酒；③腌制：瘦肉中加入準備好的腌制劑，在2℃冷藏柜腌制18 h；④灌腸：將瘦肥肉按照5∶3比例混合，發酵劑組中加入0.08%（以肉總量百分比計）的乳酸菌和0.04%的酵母菌后灌腸，對照組則不添加混合發酵劑，由于發酵12 h后感官上太酸并結合微生物的數量變化，故將2組在32±1℃下發酵12 h；⑤干燥：將發酵完畢的香腸移入70℃的烘烤室加熱2 h。分別在0，3，6，9，12 h取樣對微生物、pH值、水分活度、亞硝酸鹽、揮發性鹽基氮、生物胺進行測定。

1.2.2 pH值的測定

取5.0 g樣品加入20 mL去離子水（pH值為7.0）勻漿并振蕩30 min，然后再用數顯酸度計測定pH值[7]。

1.2.3 水分活度測定方法

根據GB/T 23490—2009肉與肉制品水分活度測定（方法二）。

1.2.4 亞硝酸鹽測定方法

根據GB 5009.33—2010食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定（方法二）。

1.2.5 揮發性鹽基氮測定方法

根據GB/T 5009.44—2003肉與肉制品衛生標準的分析方法（半微量定氮法）。

1.2.6 生物胺測定方法

根據文獻[7]中的生物胺檢測方法進行測定。

（1） 樣品預處理。取2.0 g樣品置于50 mL潔凈透明的離心管，加入10 mL現配置的濃度為0.4 mol/L高氯酸，用漩渦混合器混合均勻，靜置數分鐘后于轉速 3 000 r/min下離心15 min，過濾并收集上清液于25 mL容量瓶中，離心管中的沉淀物按上述提取方法重復提取，合并提取液，加入質量分數為100 mg/L的1,7二氨基庚烷溶液（內標） 20 μL，用0.4 mol/L高氯酸定容至刻度。

（2） 樣品衍生。衍生方法參見文獻[7]。取1.0 mL樣品處理液或生物胺混標液，加入濃度為2.0 mol/L的氫氧化鈉溶液200 μL調節pH值至11，加入300 μL配置好的飽和碳酸氫鈉和2.0 mL的10 mg/mL的丹磺酰氯，于40℃的條件下反應45 min，反應完畢加入25%的濃氨水100 μL，避光靜置30 min；用乙腈定容至5 mL，振蕩混勻，用0.22 μm有機相針式濾膜過濾后，供液相色譜使用。

（3）標準曲線的繪制。分別移取0.5 mL生物胺標準系列溶液，同樣品處理方法后，經HPLC分析，以峰面積內標法定量，根據生物胺質量濃度為橫坐標、生物胺與內標峰面積比為縱坐標制作標準曲線，得到回歸方程及其相關系數R2。樣品處理后根據標準曲線得到樣品中生物胺的含量。

（4） 色譜條件。色譜柱為C18反相色譜柱；流動相：A為0.1 mol/L乙酸銨，B為乙腈；柱溫40℃；進樣量為20μL；流速為1mL/min，檢測波長為254nm。

1.2.7 乳酸菌、菌落總數、大腸菌群、酵母菌和霉菌的測定

分別按照GB 4789.35—2016食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗、GB 4789.2—2010食品菌落總數測定、GB4789.3—2010食品大腸菌群計數（方法二）、GB 4789.15—2010食品霉菌和酵母計數（方法二）執行。

1.2.8 數據處理

每個數據重復處理3次。用SPSS statistix 16.0軟件One-way ANOVA程序進行均值計算及均值之間的差異性比較，數值以均值±標準差表示，p＜0.05即表示差異顯著。采用正版Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 發酵過程中微生物變化

2.1.1 發酵過程中乳酸菌、酵母菌數量的變化

乳酸菌代謝碳水化合物產生乳酸，降低肉制品的酸度，抑制病原微生物的生長，減少腐敗，并且有利于風味物質的形成。

發酵過程中發酵劑組與對照組乳酸菌變化趨勢見圖1。

圖1 發酵過程中發酵劑組與對照組乳酸菌變化趨勢

由圖1可知，發酵前3 h發酵劑組乳酸菌處于停滯期，從而乳酸菌數量增長比較平緩，而后開始快速增長，數量從發酵3 h的5.11±0.08 lg CFU/g達到發酵9 h的5.93±0.35 lg CFU/g，9 h后乳酸菌數量增長速度趨于平緩，這是由于發酵過程中Aw值的降低和乳酸菌自身產生的乳酸對自身的繁殖也有一定的抑制；而對照組的乳酸菌經過前3 h發酵后也開始大量繁殖，香腸中的厭氧環境使得原料中本身存在的乳酸菌在營養充足的環境中歷經一個自然篩選富集過程，數量也得到大量的增長。

接種的乳酸菌能在發酵前期快速生長繁殖為優勢菌，逐漸耗盡肉腸中殘存的氧，形成一個厭氧環境，在發酵前期抑制其他微生物的生長繁殖。

發酵過程中發酵劑組與對照組酵母菌變化趨勢見圖2。

圖2 發酵過程中發酵劑組與對照組酵母菌變化趨勢

由圖2可知，發酵劑組酵母菌數量從發酵開始一直處于下降趨勢，其數量從開始的6.39±0.03 lg CFU/g降至發酵結束時的5.61±0.02 lg CFU/g，而對照組卻處于增長的趨勢，由于前期水分含量高，營養充足，使得在前3 h增速最快，隨后增長速率變緩，從最初3.50±0.02 lg CFU/g增加到發酵結束時的4.37±0.03 lg CFU/g。發酵劑組中酵母菌的生長趨勢可能與優勢菌乳酸菌拮抗作用有關，乳酸菌對酵母菌的抑制作用主要表現在乳酸菌產生的化合物，如苯乳酸、4-羥基-苯乳酸、環肽抑制了酵母菌的生長[9]。

2.1.2 發酵過程中大腸菌群、菌落總數變化

大腸菌群是國內外通用的食品污染指示菌之一，食品中檢出大腸菌群，提示加工貯藏環境衛生條件需要改進，以及具有被致病菌污染的可能性。

發酵過程中發酵劑組與對照組大腸菌群的變化趨勢見圖3。

圖3 發酵過程中發酵劑組與對照組大腸菌群的變化趨勢

由圖3可知，發酵劑組和對照組的大腸菌群含量均呈增加趨勢，發酵前6 h 2組含量無顯著性差異（p＞0.05），6 h開始，對照組大腸菌群增加速度顯著快于發酵劑組，并在發酵結束時對照組大腸菌群含量超出發酵劑組1個對數周期以上。隨著發酵時間的延長，對照組中腐敗菌大量繁殖，對產品本身的品質產生不利的作用，使產品顏色暗淡。上述結果表明，接種了混合菌種的發酵過程很顯著地抑制了大腸菌群的生長繁殖，增強了產品的品質和抵抗雜菌的污染。

菌落總數是評估食品清潔度的微生物指標，反映食品在生產過程中是否符合衛生要求。

發酵過程中發酵劑組與對照組菌落總數的變化趨勢見圖4。

圖4 發酵過程中發酵劑組與對照組菌落總數的變化趨勢

由圖4可知，對照組的菌落總數在9 h之前增長速率大于發酵劑組，發酵劑組從發酵初始的6.12±0.02 lg CFU/g增加到發酵結束的7.45±0.06 lg CFU/g，而對照組由于隨著內源微生物大量繁殖，從發酵初始階段的4.44±0.06 lg CFU/g增長到9 h時6.55±0.22 lg CFU/g，在9 h之后2組無顯著性差異（p＞0.05）。由此可知，在相同衛生標準情況下，添加混合菌種發酵能抑制雜菌的增長。有研究者指出乳酸菌產生的細菌素在抑菌中可能同樣扮演了重要角色，特別是在那些微酸化的肉制品中[3]。

顯然，人工接種乳酸菌和酵母菌，在一定的發酵時間內，抑制了其他微生物的生長繁殖，尤其是抑制了大腸菌群的生長繁殖，降低了發酵香腸的pH值，這與發酵香腸的亞硝酸鹽、TVB-N及生物胺等有害物質的含量降低是明顯相關的。

2.2 發酵過程中pH值、水分活度的變化

發酵過程中pH值隨時間變化趨勢見圖5，發酵過程中Aw值隨時間變化趨勢見圖6。

圖5 發酵過程中pH值隨時間變化趨勢

圖6 發酵過程中Aw值隨時間變化趨勢

絕大多數腐敗細菌最適生長pH值一般是中性或者略微偏堿性，偏離最適生長pH值不利于細菌生 長[10]。由圖5可知，在發酵過程前3 h發酵劑組和對照組pH值均略有上升，分別升到5.97±0.02及6.01±0.02，發酵劑組在3 h后開始下降，對照組pH值在3 h后繼續上升，在發酵9 h后開始略有下降，至發酵結束時分別降至5.71±0.02與6.00±0.03，整個發酵過程中發酵劑組的pH值下降幅度較對照組大（p≤0.05）。在其他一些肉類發酵研究中[7-8]，pH值從發酵一開始就下降，而試驗中發酵前期pH值略微上升，可能是由于原料的差異、菌種的差異和其他因素的不同，也可能是發酵初始蛋白質代謝高于糖類代謝，產生的堿性物質使得pH值略上升，且發酵前期乳酸菌處于適應期，使得產酸效果不明顯的原因。發酵3 h后，發酵劑組乳酸菌大量繁殖產酸，使得pH值開始下降，對照組發酵后期pH值也緩慢下降，說明對照組存在自然乳酸菌發酵，但其需要經過一個自然篩選富集的過程，因此在發酵9 h后香腸的pH值才開始下降，且其下降速度要低于發酵劑組。

水分活度與微生物生長密切相關，低水分活度可抑制微生物生長。由圖6可知，發酵過程中，對照組水分活度略低于發酵劑組，都在適合微生物生長的范圍內，且二者之間沒有顯著差別。有研究表明，發酵過程中pH值與水分活度具有一定的線性關系[6]，而本試驗中分析得到pH值（Y） 與水分活度（X） 線性關系較差 （Y=49.71X-38.94，R2=0.768），可能與發酵菌種及發酵條件有關。

2.3 發酵過程亞硝酸鹽、揮發性鹽基氮的變化

發酵過程中發酵劑組與對照組亞硝酸鹽變化趨勢見圖7。

圖7 發酵過程中發酵劑組與對照組亞硝酸鹽變化趨勢

由圖7可知，發酵前6 h發酵劑組和對照組香腸的亞硝酸鹽含量差異不顯著（p＞0.05），到6 h發酵劑組及對照組分別達到0.71±0 mg/kg和0.69±0.11 mg/kg，6 h后對照組亞硝酸鹽含量增長速度越來越大，并且始終大于發酵劑組，發酵12 h后，發酵劑組亞硝酸鹽含量達到1.57±0 mg/kg，遠低于亞硝酸鹽在肉制品中的最終殘留量不得超過30 mg/kg的標準[11]，而對照組則為2.26±0 mg/kg，顯然，接種混合發酵劑對降低亞硝酸鹽含量具有明顯的效果。有文獻表示[4-5，7]，發酵過程中，以乳酸菌為優勢菌種的厭氧環境中，有害微生物生長受到抑制，從而減少硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽。另外有文獻指出，乳酸菌對亞硝酸鹽的降解與pH值有一定的關系，pH值＞4.5時，乳酸菌對亞硝酸鹽降解以酶降解為主，并且其降解能力與pH值呈現負相關[12]，這與本試驗具有一定的相似性，隨著pH值的變化，發酵劑組亞硝酸鹽呈現先降低后緩慢增加再快速增加的趨勢。

發酵過程中發酵劑組與對照組TVB-N含量變化趨勢見圖8。

揮發性鹽基氮反映的是食品中蛋白質的降解程度，產生氨用胺類等堿性含氮物質，是評價肉制品新鮮度的常用指標，過量會導致人體中毒[4-5]。由圖8可知，整個發酵進程中對照組TVB-N含量始終高于發酵劑組，發酵6 h后發酵劑組TVB-N含量略有降低，而對照組TVB-N含量一直處于上升中，發酵至12 h后，發酵劑組TVB-N含量為2.59±0.06 mg/100 g，遠低于國家標準鮮畜肉中TVB-N含量最低限量15 mg/100 g（GB 2707—2016），而對照組TVB-N含量卻達到了6.70±0.22 mg/100 g，說明混合菌種發酵能有效減少有害物質的產生，這可能是由于發酵劑組在9 h內優勢菌乳酸菌極大抑制了腐敗菌的生長，部分胺類揮發和酸性環境對降解出的堿性物質有一定的中和[13]。有文獻表示[14]，胺類能進入細胞內與糖代謝中產生的有機酸反應生成氨基酸，故可能是由于乳酸菌代謝旺盛而使發酵劑組TVB-N含量在發酵后期開始下降，導致TVB-N含量較對照組更早開始減少。

圖8 發酵過程中發酵劑組與對照組TVB-N含量變化趨勢

此外，圖2表明發酵劑組的酵母菌數始終高于對照組，酵母菌的存在與產品的風味有關，能為產品帶來期望的香氣和風味[1]。與圖8的結果對照，證實酵母菌確實大幅度降低了TVB-N含量，這顯然有利于改善發酵香腸的風味。

2.4 發酵過程中生物胺的變化

生物胺能與亞硝酸鹽生成致癌物N-亞硝胺，同時被認為是食品腐敗的標志[15]。

發酵過程發酵劑組與對照組生物胺變化見表1。

由表1可知，發酵前6 h發酵劑組PU、HI，TY，SD含量增加，隨后開始減少，發酵前3 h，SM含量增加后開始減少，并且發酵結束時PU，TY含量接近于初始發酵含量。而在對照組中，5種生物胺全都呈現增加的趨勢，到發酵結束，HI，TY，SD，SM含量達到發酵劑組的數倍；并且在發酵過程中，發酵劑組5種生物胺含量與對照組具有顯著差異性（p＜0.05）。胺的形成依賴于具有脫羧酶活性細菌的數量，優勢菌發酵劑能抑制有氨基酸脫羧酶陽性細菌的生長[16]。另外，pH值是影響氨基酸脫羧酶活性的重要因素[17]，有研究已證實香腸中生物胺的產生和由乳酸發酵造成pH值的降低之間具有相關性[17]，發酵劑組中pH值的降低，使具有氨基酸脫羧酶活性的微生物生長得到抑制，從而有效地降低生物胺的積累。到發酵12 h以后，發酵劑組5種生物胺含量為11.80±0.18 mg/100 g，而對照組生物胺含量達到32.27±0.23 mg/100 g，根據試驗可以得出，添加混合發酵劑相對傳統發酵可以使5種生物胺總量減少63.4%，從而使得產品具有更高的安全性。

表1 發酵過程發酵劑組與對照組生物胺變化/mg·（100 g）-1

3 結論

試驗證明，選擇接種乳酸菌和酵母菌混合發酵香腸，能加速乳酸菌群等益生菌的生長繁殖，很大程度上抑制腐敗菌的生長?；旌暇N發酵過程中亞硝酸鹽、TVB-N、生物胺含量均低于不添加發酵劑的自然發酵過程，說明混合菌種發酵能有效減少有害物質的產生，改善產品的質量和安全性，保障質量穩定。乳酸菌作為抑菌劑的優勢是避免了致癌物亞硝酸鹽在肉類加工中的普遍使用，可以減少亞硝酸鹽對身體的危害。

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