海蜇膠原蛋白肽的酶解制備工藝

李玉芬,鄭明星,葉秀云,林 娟

(福州大學福建省海洋酶工程實驗室,福建福州 350116)

自由基的累積會造成機體嚴重損傷,與DNA損傷、心血管疾病、衰老和癌癥等疾病息息相關。早期對機體內自由基的清除多采用一些合成類抗氧化劑,如丁羥甲苯和叔丁基羥基茴香醚等。但是由于這些合成類抗氧化劑對人體具有較強的毒副作用,我國政府已經限制了該類添加劑的用量。因此尋找天然、高效且無毒副作用的新型抗氧化劑是近幾年的研究熱點。一些研究表明,膠原蛋白肽對自由基具有良好的清除效果,是一種天然的抗氧化劑。Li等[1]使用不同蛋白酶酶解豬皮膠原蛋白,得到氨基酸序列為QGAR的抗氧化肽,具有較高的DPPH自由基清除能力、金屬離子螯合能力和脂質過氧化抑制能力。膠原蛋白肽擁有獨特的氨基酸組成,擁有多種生理功能活性[2-3],如降血壓、抗黑色素、免疫活性、促進鈣吸收和抗關節炎等,具有廣闊的應用前景。

目前制備膠原蛋白肽最常用的方法是酶解法,其工藝主要包括單酶酶解法[4]和復合酶酶解法[5]。較為常用的提取用酶為胃蛋白酶[6]、中性蛋白酶[7]、堿性蛋白酶[8]和胰蛋白酶[9]等。研究發現,單一酶作用范圍較小,只能使小部分的蛋白降解;而選用復合酶法進行水解,可有效增大底物的水解程度,可以使得更多的活性氨基酸殘基暴露出來[10]。

本文以海蜇加工下腳料為原料提取膠原蛋白,在單因素實驗的基礎上,采用響應面法對海蜇膠原蛋白肽的單酶水解工藝進行優化,并進一步與復合酶水解工藝進行比較,確定海蜇膠原蛋白肽的最優制備工藝,為海蜇加工下腳料的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海蜇加工下腳料 已除鹽的南蟄海蜇皮,海蜇體呈傘蓋狀,通體呈半透明,福建億達食品有限公司;丙酮、碳酸氫二鈉、Tris、濃鹽酸(HCl)、福林試劑、谷胱甘肽、胃蛋白酶(1.58 U/mg)、胰蛋白酶(4.40 U/mg)、還原型谷胱甘肽 國藥集團;風味蛋白酶(7.62 U/mg)、木瓜蛋白酶(13.73 U/mg)、中性蛋白酶(9.02 U/mg)、堿性蛋白酶(84.63 U/mg) Solarbio公司;2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、血管緊張素轉化酶(ACE)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)、馬尿酸、Tyrosinase Sigma公司;DPPH Aladdin公司。

T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;THZ-82恒溫振蕩器 國華企業;BC/BD-320HCN臥式冷藏冷凍轉換柜 海爾集團;TP-114分析天平、UB-7pH計 DENVER INSTRVMENT;U-2910雙光束分光光度計、CF16R-XI高速冷凍離心機 HITACHI;移液槍 Eppendorf;GL-3250C漩渦混合器 Qilinbeier;BL25H11攪拌機 廣東美的生活電器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海蜇膠原蛋白肽的提取 將海蜇加工下腳料用清水沖洗,將除鹽的海蜇用攪拌機攪碎20 min,過濾瀝干;添加丙酮溶液沒過海蜇,靜置1 d,蒸餾水清洗至無異味,過濾瀝干;置于0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液中浸泡三次,每3 h更換一次溶液,蒸餾水清洗至中性,過濾瀝干,4 ℃冰箱存放備用。

取一定質量的海蜇皮勻漿,加入一定體積相應pH的緩沖液至一定料液比,添加一定比例的蛋白酶,置于一定溫度酶解一定時間;待反應結束后,將酶解液置于沸水浴中加熱10 min使蛋白酶失活,13000 r/min離心10 min,取上清多肽液進行水解度(DH)和還原力(RP)測定。

1.2.2 緩沖液體系 Phosphate緩沖體系:pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的緩沖液由0.1 mol/L的Na2HPO4·12H2O和0.1 mol/L NaH2PO4·2H2O配制而成。

Tris-HCl緩沖體系:pH(8.0、8.5、9.0)的緩沖液由0.1 mol/L的Tris和0.1 mol/L的HCl配制而成。

1.2.3 蛋白酶的選擇 以DH和RP為指標,在酶添加量100 U/g、料液比1∶1 (g/mL)和酶解時間4 h條件下,比較六種不同蛋白酶在其最適酶解條件(見表1)下對海蜇蛋白的酶解效果,并選用最適的兩種蛋白酶用于下一步實驗研究。

表1 不同蛋白酶的最適酶解條件Table 1 Optimal enzymatic conditions of different protease

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 溫度對酶解效果的影響 在酶添加量1.0%、酶解時間2 h、料液比1∶2 (g/mL)和pH7.0條件下,考察了不同溫度(30、35、40、45、50、55 ℃)對胰蛋白酶和風味蛋白酶酶解效果的影響,測定酶解液的DH和RP。

1.2.4.2 pH對酶解效果的影響 在酶添加量1.0%、酶解時間2 h、料液比1∶2 (g/mL)和溫度45 ℃條件下,采用兩種不同緩沖體系(Phosphate緩沖體系和Tris-HCl緩沖體系)考察了不同pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)對胰蛋白酶和風味蛋白酶酶解效果的影響,測定酶解液的DH和RP。

1.2.4.3 料液比對酶解效果的影響 在酶添加量1.0%、酶解時間2 h、溫度45 ℃和pH8.0(pH7.0)條件下,比較不同料液比[3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 (g/mL)]下胰蛋白酶(風味蛋白酶)的酶解效果,測定酶解液的DH和RP。

1.2.4.4 酶添加量對酶解效果的影響 在料液比1∶1 (g/mL)、酶解時間2 h、溫度45 ℃和pH8.0(pH7.0)條件下,比較了不同酶添加量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%)對胰蛋白酶(風味蛋白酶)酶解效果的影響,測定酶解液的DH和RP。

1.2.4.5 酶解時間對酶解效果的影響 在酶添加量3.0%(酶添加量4.0%)、料液比1∶1 (g/mL)、溫度45 ℃和pH8.0(pH7.0)條件下,測定不同酶解時間(2、3、4、5、6、7 h)下胰蛋白酶(風味蛋白酶)酶解液的DH和RP。

1.2.5 酶解膠原蛋白的響應曲面實驗

1.2.5.1 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上,以DH和RP為響應值,以蛋白酶的酶解溫度、pH和料液比作為自變量進行響應曲面實驗,在Box-Behnken中心組合實驗進行設計,確定海蜇蛋白單酶最優酶解工藝。胰蛋白酶因素水平編碼表見表2,風味蛋白酶因素水平編碼表見表3。

表2 胰蛋白酶響應面實驗設計因素水平編碼表Table 2 Factors and levels of trypsase response surface experimental design

表3 風味蛋白酶響應面實驗設計因素水平編碼表Table 3 Factors and levels of flavourzyme response surface experimental design

1.2.6 復合酶酶解工藝研究

1.2.6.1 混合酶解 將兩種蛋白酶A、B混合,分別在蛋白酶A和蛋白酶B的最適酶解條件下對膠原蛋白進行酶解,測定DH和RP,比較混合酶對膠原蛋白酶解效果的影響。

1.2.6.2 先后酶解 在蛋白酶A(蛋白酶B)最適的酶解條件下進行酶解,繼而添加蛋白酶B(蛋白酶A),在蛋白酶B(蛋白酶A)最適的酶解條件下酶解,測定DH和RP比較先后酶解對膠原蛋白酶解效果的影響。

1.2.7 DH的測定 采用茚三酮法[11],按下式(1)計算DH。

式(1)

式中:DH:蛋白水解度,%;h1:每克原料水解液中游離氨基酸的含量,μmol/g;h0:每克原料溶液中游離氨基酸的含量,μmol/g;h2:對照溶液中游離氨基酸的含量,μmol/g。

1.2.8 RP的測定 參考Liu等[12]的方法,略有修改。在15 mL試管中,依次加入1 mL不同濃度的多肽樣品、2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液;置于50 ℃水浴反應20 min,加入1 mL 10%的三氯乙酸終止反應;取上述溶液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,于700 nm處測定其吸光值。吸光值越大表明樣品的RP越高。以蒸餾水作為空白對照,同時以谷胱甘肽(GSH)作為陽性對照。其IC50值定義為相對空白組吸光值為0.5時，有效多肽濃度。

1.3 數據處理

利用Design-Expert 8.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

由圖1可知,不同蛋白酶酶解液的DH和RP存在一定的差異;堿性蛋白酶和風味蛋白酶酶解制備的水解液DH最高,分別為36.33%和43.67%,其次為胰蛋白酶(21.92%)和中性蛋白酶(19.17%),胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解液的DH最低。胰蛋白酶酶解液的RP(0.246)最大,風味蛋白酶(0.122)次之,其余蛋白酶酶解液的RP均較低?？梢钥闯?胰蛋白酶酶解液雖然DH不高,但是其RP是所有蛋白酶酶解液中最高的;而堿性蛋白酶酶解液恰恰相反,擁有較高的DH,其RP卻只有0.086;這可能是因為與堿性蛋白酶相比,胰蛋白酶的酶切位點暴露出了更多的活性位點,從而使得水解液擁有更高的RP。綜合比較了六種不用蛋白酶的酶解效果,在后續的實驗中選取了具有最高RP的胰蛋白酶和最高DH的風味蛋白酶進行下一步單酶酶解工藝優化。

圖1 不同蛋白酶的酶解效果比較Fig.1 Effect of different protease treatment on the hydrolysis of protein

2.2 胰蛋白酶酶解制備膠原蛋白肽的工藝優化

2.2.1 單因素實驗 胰蛋白酶酶解制備膠原蛋白肽的單因素實驗結果如圖2～圖6所示,溫度對胰蛋白酶酶解液的DH和RP的影響趨勢類似;隨著反應溫度的升高,酶解液的DH和RP也隨之升高,在45 ℃時達到最大值(圖2);在pH8.0時胰蛋白酶酶解液DH和RP均達到最大,偏離該pH,酶解液的DH和RP都呈小幅度的降低(圖3);在一定范圍內,隨著液料比的減小,胰蛋白酶酶解液的DH和RP呈先增大后減小的趨勢,在液料比為1∶1 (g/mL)時,DH和RP最大(圖4);胰蛋白酶酶解液DH和RP都隨酶添加量的增加而增大,在酶添加量大于3.0%時,DH的增大趨勢趨于平緩,RP則保持在同一水平(圖5);在一定范圍內,胰蛋白酶酶解液DH和RP隨酶解時間的延長而增大,在4 h之后,DH變化趨于平穩,而RP反而有所下降(圖6)。最終確定最佳酶解條件為:酶解溫度為45 ℃,pH為8.0,料液比為1∶1 (g/mL),酶添加量為3.0%,酶解時間為4 h。當酶解時間大于4 h,加酶量超過3.0%,膠原蛋白的DH和RP趨于穩定,由于單因素實驗結果顯示酶解溫度、pH、料液比對實驗結果的影響比時間和酶添加量對實驗影響明顯。因此在此基礎上,進一步采用響應曲面法研究酶解溫度、pH、料液比對DH和RP的影響。

圖2 不同溫度酶解效果的影響Fig.2 Effect of different temperatures on the hydrolysis of protein

圖3 不同pH對酶解效果的影響Fig.3 Effect of different pH values on hydrolysis of protein

圖4 不同料液比對酶解效果的影響Fig.4 Effect of different ratios of material to solvent on hydrolysis of protein

圖5 不同酶添加量對酶解效果的影響Fig.5 Effect of different proportion of enzymes on hydrolysis of protein

圖6 不同酶解時間對酶解效果的影響Fig.6 Effect of different time on hydrolysis of protein

2.2.2 響應曲面實驗設計 響應曲面實驗設計及結果如表4所示。

利用Design-Expert 8.0軟件對表4的實驗結果進行回歸分析,得到DH(Y1)和RP(Y2)的回歸方程分別為:

表4 響應面實驗方案及結果Table 4 Design matrix and the correspondingresults of RSM experiments

Y1=28.50-0.60X1+1.01X2-0.084X3-0.17X1X2+0.19X1X3+0.34X2X3-2.00X12-1.18X22-0.44X32

Y2=24.26-0.42X1+1.18X2-0.12X3-0.32X1X2+1.00X1X3+0.84X2X3-1.97X12-2.29X22-0.73X32

進一步對上述模型及回歸方程進行方差分析,結果如表5所示。兩種模型的p<0.01,失擬項均大于0.05,表明模型效應顯著且具有較好的擬合度。對于DH,X1、X2、X2X3、X12、X22和X32均有極顯著的影響(p<0.01),X3和交互項X1X2、X1X3在所取水平范圍內對DH影響不顯著(p>0.05);對于RP,X2、X1X3、X2X3、X12、X22和X32均有極其顯著的影響(p<0.01),而X1有顯著性差異(p<0.05),X3和交互項X1X2在所取水平范圍內對RP影響不顯著(p>0.05);由各項的F值可知,各因素對DH的影響程度次序與對RP的影響程度次序一致,依次為X2(pH)>X1(溫度)>X3(料液比)。

表5 方差分析表Table 5 Analysis of variance

2.2.3 響應曲面分析與優化 由方差分析結果各項的F值可知,各因素對DH的影響程度次序與對RP的影響程度次序一致,因此主要對RP的三維響應面圖和等高線圖進行分析。以胰蛋白酶酶解液RP為響應值的三維響應面圖及等高線圖如圖7所示。由圖7可知,在一定范圍內,隨著各因素值的增加,胰蛋白酶酶解液RP均呈不同程度的先上升后下降的趨勢。結合等高線圖可知,pH對酶解液RP的影響較溫度顯著(圖7a);溫度對酶解液RP的影響較料液比顯著(圖7b);pH對酶解液RP的影響較料液比顯著(圖7c)。

圖7 胰蛋白酶酶解液RP的響應面及等高線圖Fig.7 Response surface and contourlines of reducing power of enzymatic hydmlysatcs注:a：溫度和pH對RP的影響;b：溫度和料液比對RP的影響;c：pH和料液比對RP的影響。

利用已建立的數學模型得出胰蛋白酶的最優酶解條件為:溫度43.50 ℃、pH8.33和料液比0.50 g/mL,此時酶解液DH為28.76%,RP為0.24。根據實驗條件,將最佳參數調整為:溫度44 ℃,pH8.5,料液比0.50 g/mL,并在此條件下進行驗證實驗,得到DH為(28.26%±0.47%),RP為(0.247±0.002),與理論值有較好的擬合性。

2.3 風味蛋白酶酶解制備膠原蛋白肽的工藝優化

2.3.1 單因素實驗 風味蛋白酶酶解制備膠原蛋白肽的單因素實驗結果如圖8～圖12所示,在45 ℃時,風味蛋白酶酶解液的DH和RP最大,分別為24.96%和0.054(圖8);在pH7.0時,風味蛋白酶酶解液的DH(25.29%)和RP(0.054)最大(圖9);在1∶1 (g/mL)料液比時,擁有最高的DH(25.84%)和RP(0.061)(圖10),風味蛋白酶酶解液DH和RP隨酶添加量的增加而增大,在酶添加量4.0%之后,酶添加量的增加對DH和RP的影響不大(圖11);風味蛋白酶酶解液DH在4 h之后時趨于平穩,RP隨酶解時間的延長先升高后降低,在4 h時達到最大0.118(圖12)。最終確定風胃蛋白酶最佳酶解條件為:酶解溫度為45 ℃,pH為7.0,料液比為1∶1 (g/mL),酶添加量為4.0%,酶解時間為4 h,當酶解時間大于4 h,加酶量超過4.0%,膠原蛋白的DH和RP趨于穩定,由于單因素實驗的優化結果顯示,酶解溫度、pH、料液比對實驗結果影響較酶解時間、酶添加量影響大,因此在此基礎上,進一步采用響應曲面法研究酶解溫度、pH、料液比對DH和RP的影響。

圖8 不同溫度對酶解效果的影響Fig.8 Effect of different temperatures on the hydrolysis of protein

圖9 不同pH對酶解效果的影響Fig.9 Effect of different pH on hydrolysis of protein

圖10 不同料液比對酶解效果的影響Fig.10 Effect of different ratios of material to solvent on hydrolysis of protein

圖11 不同酶添加量對酶解效果的影響Fig.11 Effect of different proportion of enzymes on hydrolysis of protein

圖12 不同酶解時間對單酶酶解效果的影響Fig.12 Effect of different time on hydrolysis of protein

2.3.2 響應曲面實驗設計 響應曲面實驗設計及結果如表6所示。

利用Design-Expert 8.0軟件對表6的實驗結果進行回歸分析,得到DH(Y3)和RP(Y4)的回歸方程分別為:

表6 響應面實驗方案及結果Table 6 Design matrix and the corresponding results of RSM experiments

Y3=47.96-1.16X1+0.98X2+1.78X3+0.045X1X2+0.37X1X3+0.015X2X3-5.16X12-0.94X22-1.65X32

Y4=13.18-0.12X1-0.32X2+0.20X3+0.28X1X2+0.27X1X3-0.13X2X3-0.48X12-0.83X22-0.38X32

對上述模型及回歸方程進行的方差分析如表7所示。兩種模型的p<0.01,失擬項均大于0.05,表明模型效應顯著且具有較好的擬合度。對于DH,X1、X2、X3、X12和X32均有極其顯著的影響(p<0.01),而X22有顯著性差異(p<0.05),交互項X1X2、X1X3、X2X3在所取水平范圍內均對DH影響不顯著(p>0.05);由各項的F值可知,各因素對DH的影響程度次序依次為X3(料液比)>X1(溫度)>X2(pH)。對于RP,X2、X12、X22和X32均有極其顯著的影響(p<0.01),而X3、X1X2、X1X3有顯著性差異(p<0.05),X1和交互項X2X3在所取水平范圍內對RP影響不顯著(p>0.05);由各項的F值可知,各因素對RP的影響程度次序與對DH的影響程度次序有差異,依次為X2(pH)>X3(料液比)>X1(溫度)。在下文主要對RP的三維響應面圖和等高線圖進行進一步分析。

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance

2.3.3 響應曲面分析與優化 以風味蛋白酶酶解液RP為響應值的三維響應面圖及等高線圖如圖14所示。在該實驗范圍內,隨著各因素值的增加,風味蛋白酶酶解液的RP先增大后減小。結合等高線圖可知,pH對酶解液RP的影響較溫度顯著(圖14a);溫度和料液比對酶解液RP影響的顯著性差異不大(圖14b);pH對酶解液RP的影響較料液比顯著(圖14c)。

圖14 風味蛋白酶酶解液RP的響應面及等高線圖Fig.14 Response surface and contourlines of reducing power of enzymatic hydmlysatcs

構建數學模型分析,得出風味蛋白酶的最優酶解條件為:溫度44.10 ℃、pH7.39和料液比0.56 g/mL,在該條件下獲得的酶解液DH預測值為48.32%,RP預測值為0.13。根據實驗條件,將最佳參數調整為:溫度44 ℃、pH7.5、料液比0.56 g/mL,并在此條件下進行驗證實驗,得到酶解液的DH為(48.26%±0.47%)、RP為(0.14±0.001),與理論值有較好的擬合性。

2.4 復合酶酶解工藝研究

在上述單酶工藝優化的基礎上,比較兩種蛋白酶不同組合方式(表8)的酶解效果,確定海蜇膠原蛋白的最優復合酶解工藝。

由表8可知,B+A的酶解類型所得的DH(71.56%±0.11%)和RP(0.341±0.001)比其他酶解類型所得的DH和RP均高,所以復合酶的最佳組合方式確定為:先于溫度44 ℃、pH7.5、料液比0.56 g/mL和風味蛋白酶添加量4.0%條件下酶解4 h,再于溫度44 ℃、pH8.5、料液比0.50 g/mL和胰蛋白酶添加量3.0%條件下繼續酶解4 h,所獲得水解液的DH和RP分別為:(71.56%±0.0076%)和(0.341±0.0101)。

表8 不同蛋白酶組合方式對海蜇蛋白酶解效果的影響Table 8 Effect of different combinations of proteases on hydrolysis of protein from jellyfish

3 結論

以DH和RP為指標,比較了6種常用蛋白酶對海蜇蛋白的酶解效果,確定胰蛋白酶和風味蛋白酶為最佳水解酶。采用單因素和響應面BBD分別對這兩種蛋白酶的酶解工藝進行優化,在實際實驗條件下確定胰蛋白酶的最優酶解條件為:溫度44 ℃、pH8.5、料液比0.50 g/mL、酶添加量3.0%和酶解時間4 h;風味蛋白酶的最優酶解條件為:溫度44 ℃、pH7.5、料液比0.56 g/mL、酶添加量4.0%和酶解時間4 h;進一步選取上述兩種蛋白酶進行復合酶解實驗,確定復合酶的最佳組合方式為:風味蛋白酶和胰蛋白酶先后酶解,所獲得水解液的DH和RP分別為(71.56%±0.0076%)和(0.341±0.0101)。

[1]Li B,Chen F,Wang X,et al. Isolation and identification of antioxidative peptides from porcine collagen hydrolysate by consecutive chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry[J]. Food Chemistry,2007,102(4):1135-1143.

[2]馬華威. 雙酶分步酶解制備鮟鱇魚皮膠原蛋白肽及生物活性的研究[D]. 浙江:浙江海洋學院,2014.

[3]丁進鋒,蘇秀榕,李妍妍,等. 海蜇膠原蛋白肽的降血脂及抗氧化作用的研究[J]. 天然產物研究與開發,2012,24(3):362-365.

[4]劉尊英,李八方,曾名勇,等. 鱈魚皮膠原蛋白胰蛋白酶控制水解動力學模型[J]. 食品科技,2008,33(2):75-77.

[5]朱俊穎,王耀松,趙黎明,等. 復合酶法制備高純度魚基質膠原蛋白肽[J]. 中國食品學報,2015,15(12):47-54.

[6]申鋒,楊莉莉,熊善柏,等. 胃蛋白酶水解草魚魚鱗制備膠原肽的工藝優化[J]. 華中農業大學學報,2010,29(3):387-391.

[7]陳露. 鯉魚魚鱗膠原蛋白肽的制備工藝和分析[D]. 內蒙古:內蒙古農業大學,2013.

[8]閔瑞. 微波輔助酶解提取硫酸軟骨素下腳料中膠原蛋白肽的工藝研究[J]. 糧食與食品工業,2016,23(3):51-54.

[9]東忠方,閆鳴艷. 安康魚魚皮膠原蛋白多肽酶法制備工藝研究[J]. 食品工業,2013,34(3):87-90.

[10]朱靜靜,潘道東,孫楊贏,等. 酶解法制備膠原蛋白肽及其抗氧化活性的研究[J]. 寧波大學學報:理工版,2016,29(4):26-32.

[11]蔣婧. 蛋白質水解度測定及其標準曲線繪制研究[J]. 廣東輕工職業技術學院學報,2012,11(1):4-6.

[12]Liu J,Jin Y,Lin S,et al. Purification and identification of novel antioxidant peptides from egg white protein and their antioxidant activities[J]. Food Chemistry,2015,175:258-266.