BSP和整合素αvβ3在口腔鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

侯 捷 王海霞 張玲敏 毛立民

口腔鱗狀細胞癌是最常見的口腔頜面部惡性腫瘤，是世界范圍內第8大常見癌癥[1]，每年全世界新增病例超過30萬例[2]。近20年來，盡管其發病機制與治療方法得到廣泛研究與發展，但口腔癌患者5年生存率仍維持在50%[1]。

口腔鱗癌具有快速增長，高度局部浸潤和頸淋巴結轉移的特性[3]。當前，口腔鱗癌的預后判斷主要依靠腫瘤的原發部位、大小、是否發生頸淋巴結轉移以及有無遠處轉移。然而，口腔鱗癌的生物學行為具有顯著異質性，并且臨床分期相同的腫瘤，其臨床進程及治療反應不盡相同。因此，確定腫瘤侵襲、轉移的關鍵因素，建立新的診斷和預后判斷方法以及采用新的治療策略顯得尤其重要。

相關研究顯示，BSP與腫瘤的浸潤、轉移存在相關性[4]，且BSP均不同程度上受到整合素αvβ3的誘導作用。近年研究表明BSP和整合素αvβ3存在于各種腫瘤，如肺癌[5]，乳腺癌[6]，甲狀腺癌[7]等。兩者在口腔鱗狀細胞中的研究未見報道?；谶@一背景，本研究通過免疫組織化學法檢測BSP及整合素αvβ3在OSCC及正?？谇火つぶ械谋磉_，分析二者表達與OSCC臨床病理特征的關系以及兩者相關性，以期為OSCC的診斷及預后評估提供應用價值。

一、材料和方法

1.一般材料

（1）標本選擇：收集哈爾濱醫科大學附屬第一醫院口腔頜面外科2013～2016年手術切除的，術前未采用任何針對腫瘤的治療，如放療、化療等，經組織蠟塊保存完好的口腔鱗癌標本。均經常規病理檢查確診為鱗狀細胞癌。

（2）臨床資料：口腔鱗癌患者例，男46例，女14例，年齡42～78歲，平均60歲。依據國際抗癌聯盟（UICC）2010年關于惡性腫瘤TNM分期的規定將病例分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期，其中Ⅰ期～Ⅱ期35例，Ⅲ期～Ⅳ期25例。依據世界衛生組織（WHO）組織學分化程度標準將病例分類，高分化34例，中低分化26例。術后病理結果頸淋巴結轉移者25例，無淋巴結轉移者35例所收集的石蠟標本均由病理學專業醫師證實并且臨床資料齊全。同時選取20例口腔正常黏膜組織標本作為免疫組化染色的實驗對照，所有患者既往身體健康，無腫瘤病史。

（3）主要試劑：一抗兔抗人BSP多克隆抗體（abcam公司，英國），鼠抗人Integrinαvβ3鼠單克隆抗體（SANTA CRUZ公司美國），二抗羊抗兔，羊抗鼠，濃度為1∶50；封閉用正常羊血清，濃度為1∶10（北京索萊寶科技有限公司）通用型SP免疫組化檢測試劑盒及DAB試劑盒（博士德生物有限公司）。

2.實驗方法

（1）免疫組化方法：60例OSCC組織和20例正?？谇火つそM織石蠟標本制成4μm切片后常規脫蠟至水，抗原修復后按照說明書步驟進行免疫組化染色，顯微鏡下觀察切片。

（2）結果判定：BSP蛋白表達以細胞質或細胞核周圍區域中出現黃色或棕黃色顆粒為陽性；Integrin αvβ3蛋白表達在癌細胞漿或細胞膜中出現黃色或棕黃色顆粒為陽性。結合腫瘤細胞染色的百分比及染色強度進行評分：陽性細胞數≤10%為0分，陽性細胞數11%～50%為1分，陽性細胞數51%～75%為2分，陽性細胞數＞75%為3分。按染色強度評分：無黃色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色陽性細胞數與染色強度之和≥3分者為陽性表達，＜3分者為陰性表達。

3.統計學方法

用Excel收集數據，采用SPSS 17.0統計學軟件進行統計學分析。計數資料以頻數和百分數（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman秩相關系數分析相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

二、結果

1.BSP和Integrinαvβ3在OSCC及正常組織中的表達

BSP在OSCC細胞質或細胞核周圍區域中呈高表達，而在正常上皮無表達或極少數弱表達；Integrinαvβ3定位于OSCC細胞細胞漿或細胞膜內，正常上皮細胞基底層表達極弱（圖1）。在口腔鱗癌組織中，BSP、整合素αvβ3的表達強度顯著高于口腔正常黏膜組織（P＜0.01）（表1）。

圖1 免疫組化檢測BSP和Integrinαvβ3在口腔鱗癌及口腔正常黏膜組織中的表達（SP ×200）

表1 BSP與Integrinαvβ3在OSCC及正常組織中的表達

表2 BSP與Integrin αvβ3表達與OSCC臨床病理特征的關系

2.BSP、Integrinαvβ3的表達與OSCC臨床病理因素分析

60例OSCC患者中，BSP、Integrinαvβ3的表達水平與性別，年齡無明顯差異（P＞0.05）。而均與分化程度、TNM分期，淋巴結轉移相關。分化程度越低、TNM分期在Ⅲ～Ⅳ，發生淋巴結轉移，BSP和Integrinαvβ3相對表達明顯增高，具有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

3.BSP與Integrinαvβ3在口腔鱗狀細胞癌中表達的相關性

采用Spearman秩相關系數檢驗，結果顯示OSCC組BSP與Integrinαvβ3間相關系數為r＝0.257（P＜0.05），二者存在正相關性，表明BSP的表達隨Integrinαvβ3的表達增強而增強（表3）。

表3 BSP和αvβ3在OSCC組織中表達的相關性

三、討論

口腔鱗狀細胞癌（OSCC） 是口腔科最常見的惡性腫瘤之一。細胞外基質（exnacellular matrix，ECM）不僅決定細胞的形態，還可控制細胞的生長、分化，調節細胞的運動。一般狀態下，ECM通過不斷生長和降解保持動態平衡，其蛋白聚糖、膠原蛋白、彈性蛋白的成分降解主要依靠蛋白水解酶的作用。腫瘤細胞的侵襲轉移過程常常伴有細胞外基質的降解。侵襲和轉移是惡性腫瘤最基本的生物學特征。

骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）是一種高度糖基化、磷酸化、硫酸化的多功能非膠原蛋白，屬 于 SIBLING（small integrin binding ligand，N-linked Glycoprotein）蛋白家族[8]，其主要分布于礦化相關組織，在多種惡性腫瘤中也有異常表達。Bellahecene等[9]人首先闡述了BSP基因在骨轉移的人乳腺癌中表達，由此也成為研究乳腺癌易發生骨轉移的開端，并奠定了基礎，推動了更深一步來研究BSP在腫瘤發生發展中的作用。此外，Tang H[10]等人發現BSP的異常表達可能在ESCC的惡性進展及預后有顯著的作用，并與其分化程度和淋巴結轉移有關，可能是反映ESCC的生物學行為的一個標志。BSP是骨細胞外基質中的重要蛋白。有研究報道[11]，MMP是鋅依賴的內切酶超家族，它幾乎能降解所有的ECM成分，BSP可促進腫瘤細胞分泌MMP，并提高MMP活性，增強腫瘤細胞突破ECM能力，促進腫瘤細胞成功轉移到其他組織。

整合素是一種廣泛分布于各種脊椎動物細胞膜表面受體，在多種腫瘤表面的異常表達，對癌細胞發展具有十分重要的作用，整合素αvβ3是由αv亞基和β3亞基組成的異源二聚體，是整合素家族的重要成員。研究發現整合素αvβ3與配體結合后激活了胞內的多條信號傳導通路，影響細胞的形態變化、增殖、凋亡等生物學行為，進而促進腫瘤細胞侵襲轉移的發生[12]。其不僅可以介導細胞和ECM間、以及細胞和細胞間的粘附作用，還能作為一種信號轉導分子傳遞信號。

腫瘤細胞彼此間黏附能力減弱而腫瘤細胞與宿主細胞及ECM間的黏附能力增加，有利于腫瘤 細胞脫離母體腫瘤，是實現轉移的第一步。此過程由細胞黏附分子所介導，細胞黏附分子主要有選擇素、整合素、免疫球蛋白超家族、鈣勃素等。Oldberg等人[13]首次證實了整合素是BSP的受體，BSP通過RGD細胞識別序列與骨肉瘤細胞表面整合結合，并介導癌細胞表面與ECM間的黏附作用。其次新生血管的形成對原發性腫瘤細胞的生長和增殖是不可缺少的，可使腫瘤從無血管的緩慢生長階段進人快速增殖階段。隨著腫瘤微血管密度的增加，腫瘤侵襲轉移等惡性潛能也增強。血管生成進程依賴于內皮細胞和ECM中特異分子的相互作用，整合素介導了這一過程。整合素在靜止的血管細胞中低表達或不表達，而在處于生理或病理狀態中的血管生成內皮細胞中高表達，而BSP的RGD基序恰是整合素αvβ3的識別位點。許多研究發現BSP是一種血管生成因子，具有調解血管內皮細胞赫附、遷移，誘導血管生成的作用[14]。

我們研究還發現，在口腔正常上皮BSP和整合素αvβ3基本不表達。在口腔鱗癌組織中，BSP和整合素αvβ3的表達強度顯著高于口腔正常黏膜組織。這表明隨著上皮細胞異型性的加重，BSP和整合素αvβ3的表達量增加。BSP和整合素αvβ3的表達與腫瘤的分化程度，TNM分期，淋巴結轉移呈正相關，提示兩者對腫瘤的發生發展有協同促進作用。因此我們認為，兩者在口腔癌局部組織可能存在調控關系。

綜上所述，BSP和整合素αvβ3在口腔鱗癌中表達增加，并與口腔鱗癌的浸潤、轉移密切相關，可作為口腔鱗癌患者預后判斷指標及治療的靶向目標。未來期間對于BSP和整合素αvβ3的相關性及調控關系需進一步研究證實。

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5 Papotti M，Kalebic T，Volante M，et al.Bone sialoprotein is predictive of bone metastases in resectable non-small-cell lung cancer:a retrospective case-control study.J Clin Oncol，2006，24（30）:4818-4824.

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7 Bellahcene A，Albert V，Pollina L，et al.Ectopic expression of bone sialoprotein in human thyroid cancer.Thyroid，1998，8（8）:637-641.

8 Jain A，Karadag A，Fohr B，et al.Three SIBLINGs enhance factor H’s cofactor activity enabling MCP-like cellular evasion of complement-mediated attack.J Biol Chem，2002，277（16）：13700-13708.

9 Bellahcene A，Merville MP，Castronovo V.Expression of bone sialoprotein，a bone matrix protein，in human breast cancer.Cancer Res，1994，54（11）：2823-2826.

10 Tang H，Wang H，Wang L，et al.Expression and significance of bone sialoprotein （BSP） in esophageal squamous cell carcinoma， Zhonghua Zhong Liu Za Zhi， 2014， 36（8）:602-605.

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