3種濃度乙醇提取的樟芝多糖對免疫缺陷小鼠模型免疫功能的調節作用研究

孔云 官俏兵 郭麗 李文燕 楊毅

有研究發現，雪靈芝多糖被證明有免疫增強作用[1-2]。樟芝作為臺灣地區獨有的一種天然多孔真菌，含有豐富的多糖、三萜、腺苷、氨基酸、蛋白質類物質[3]，其中多糖和三萜含量遠遠高于靈芝，有著很好的研究價值和應用前景[4-5]。但樟芝多糖在大陸分布較少，對于其多糖的作用尚未明確，因此筆者以多糖的免疫增強作用為切入點，進一步研究其藥理作用，為樟芝多糖的開發研究提供借鑒，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級小鼠60只，體重（21±5）g，購置于浙江中醫藥大學動物實驗中心[實驗動物許可證號：SCXK（浙）2013-0184]，小鼠分籠飼養，每籠 6只，共 10籠。動物實驗室溫度為 20～25℃，濕度為（70±5）%，依據國家標準嚙齒類動物干燥飼料喂養，小鼠活動、攝食自由。

1.2 試劑和儀器 固體樟芝總多糖（杭州眾芝康公司，純度85%），環磷酰胺（浙江海正藥業），K562細胞（武漢普諾賽生物技術有限公司），刀豆蛋白A（ConA，美國Sigma公司），胎牛血清（FBS，美國 Gbico公司），二甲基亞砜（DMSO，美國 Sigma公司），RPMI1640完全培養基（美國Gibco公司），Elisa試劑盒（南京建成生物優先公司），CD3-FITC、CD4-PI、CD8-PerCP 單抗（美國 BioLegend公司），酶標儀（美國Thermo公司，型號為Multuskan Go 1510），顯微鏡（Olympusix71，德國徠卡公司），流式細胞儀（FASCC，美國BD公司）。

1.3 水提醇沉法提取樟芝多糖 本實驗采用已經過初步提取和純化的樟芝總多糖，將30g 85%樟芝總多糖溶于100ml熱水，采用Sevag方法脫蛋白5次，提取水層后濃縮至原體積的10%，使用無水乙醇將樟芝多糖水溶液調節乙醇濃度為90%，4℃條件下靜置12h，獲得第一部分沉淀記為PW90，以此類推分別獲得70%乙醇沉淀多糖記為PW70、50%乙醇沉淀獲得的多糖記為PW50。采用硫酸-蒽酮法測定總多糖，BCA法測定總蛋白含量。

1.4 模型構建和分組 將清潔級小鼠60只隨機分為對照組、模型組、總多糖組、PW90組、PW70組和PW50組，每組10只。除對照組外，其余5組小鼠按照50mg/kg的劑量，2d/次腹腔注射環磷酰胺-0.9%氯化鈉溶液（將1g環磷酰胺溶解于1 000ml的0.9%氯化鈉注射液，配制成1mg/ml的溶液）。而樟芝多糖的4組小鼠除注射環磷酰胺外，按100mg/（kg·d）的劑量腹腔注射含樟芝多糖的0.9%氯化鈉注射液（將1g樟芝多糖溶解于500ml的0.9%氯化鈉注射液，配制成2mg/ml的溶液）。其中總多糖組配制總多糖-0.9%氯化鈉注射液（2mg/ml），而PW90組、PW70組和PW50組分別使用分級沉淀的多糖組分配制成2mg/ml的樟芝多糖-0.9%氯化鈉注射液。對照組和模型組小鼠則每日注射等劑量的0.9%氯化鈉注射液，按照上述方法干預14d后，斷頸處死小鼠，無菌條件下分離脾臟、胸腺和外周血。

1.5 脾臟、胸腺指數的計算 脾臟指數=脾臟質量/小鼠的體重；胸腺指數=胸腺質量/小鼠體重。

1.6 脾臟提取淋巴細胞 無菌條件下得到的小鼠脾臟，剔除脂肪、結締組織后用無菌手術剪剪成小塊，然后研缽中研磨，加入3ml的0.9%氯化鈉溶液后過濾，將過濾液1 500r/min離心5min，加入3倍體積的紅細胞裂解液后重新混懸，離心后棄上清液得到沉淀細胞，用PBS重懸后調整細胞密度為2×106/ml。

1.7 淋巴細胞的增殖指數 將上述得到的淋巴細胞按照100μl/孔接種于96孔板，每組設置5個復孔，加入0.5mg/ml的ConA培養液1μl，培養箱中培養6h，利用CCK-試劑盒檢測450nm處吸光度（OD）。淋巴細胞增殖指數=實驗組OD/對照組OD。

1.8 NK細胞的殺傷活性檢測 將上述淋巴細胞200μl接種于96孔板，按照效-靶比為25∶1的比例加入等細胞數量的K562細胞8μl，設置效應細胞組、靶細胞組和對照組，每組設置5個復孔，培養48h后，以CCK-8法檢測OD值，NK細胞的殺傷活性=[1-（效-靶細胞OD-效應細胞 OD）/靶細胞 OD]×100%。

1.9 T淋巴細胞亞群的檢測 上述淋巴細胞吸取100μl加入流式細胞測試管，分別加入CD3、CD4、CD8抗體各1μl，混勻后避光 20min，PBS洗后離心 2次，用 PBS重懸后上機檢測。

1.10 血清IL-2、IL-6、TNF-α 檢測 小鼠斷頸處死后，取小鼠外周血2ml，離心后取血清，按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.11 統計學處理 應用SPSS 13.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較經Bonferoni校正后采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乙醇沉淀多糖的純度和蛋白含量結果 PW90、PW70、PW50的多糖含量分別為92.3%、89.8%和91.6%，蛋白含量分別為2.17、1.86、1.95mg/g。多糖含量均高于總多糖的85%，純度較高。

2.2 各組小鼠胸腺、脾臟指數的比較 模型組小鼠胸腺、脾臟指數均低于對照組（均P＜0.05），3種樟芝多糖干預后可以不同程度提高胸腺、脾臟指數，且PW90組干預后胸腺、脾臟指數高于PW70組和PW50組（均P＜0.05）；3種多糖的胸腺指數和脾臟指數均高于總多糖（均P＜0.05），見表 1。

表1 各組小鼠胸腺、脾臟指數的比較（mg/g）

2.3 各組小鼠淋巴細胞增殖指數及NK細胞殺傷活性的比較 模型組小鼠的淋巴細胞增殖指數低于對照組（P＜0.05），而樟芝多糖干預后顯著提高了淋巴細胞的增殖指數。PW90組干預后可以顯著提高NK細胞的殺傷活性，與PW70組和PW50組、總多糖組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠淋巴細胞增殖指數和NK細胞殺傷活性的比較

2.4 各組小鼠淋巴細胞亞群的比較 模型組CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+的比例均顯著低于對照組（均P＜0.05），而樟芝多糖可以顯著提高3者的比例，且PW90組優于PW70組和PW50組、總多糖組（均P＜0.05），見表 3。

表3 各組小鼠淋巴細胞亞群的比較

2.5 各組小鼠IL-2、IL-6、TNF-α的比較 模型組小鼠的IL-2、IL-6和TNF-α的表達均顯著低于對照組（均P＜0.05），而樟芝多糖可以顯著提高小鼠血清IL-2、IL-6和TNF-α的表達，與模型組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），且PW90組優于PW70組和PW50組、總多糖組（P＜0.05），見表 4。

表4 各組小鼠IL-2、IL-6、TNF-α的比較

3 討論

免疫系統是人抵御細菌、病毒感染的重要防線，而自身免疫功能的降低或者亢進都會引起一系列疾病的發生，比如類風濕性疾病、細菌感染、病毒感染等，臨床中腫瘤的輔助性化療亦會引起不同程度的免疫抑制，所以免疫增強藥物的問世和應用就顯得十分的必要[6-7]，環磷酰胺是一種常用細胞毒性藥物，臨床應用于各種惡性腫瘤的化療和類風濕關節炎的治療，也常被用于免疫抑制模型的構建[8]。本研究發現，環磷酰胺可以全面抑制小鼠的細胞免疫和體液免疫，這一模型可以廣泛的應用于免疫抑制或缺陷疾病病理和藥物的研究。

多糖作為一個大家族的天然藥物，有著多樣的生理活性和作用，目前黃芪多糖、靈芝多糖和香菇多糖已經被開發成藥物應用于免疫性疾病的輔助治療，且獲得了良好的效果，而樟芝作為大陸不常見的多孔真菌，與靈芝、云芝等有著很大的相似性，且天然的樟芝多糖含量遠遠高于靈芝，有著巨大的開發價值。以往有文獻報道樟芝胞內和胞外多糖對于免疫抑制小鼠有著一定的免疫調節功能[9]，但是對于其確切的有效多糖成分未見說明，且多糖未經過除蛋白等純化工藝，不能明確其有效的藥理成分。鑒于此，本研究利用水提醇沉法對樟芝子實體的多糖進行提取純化獲得了3種多糖，分別為90%、70%、50%乙醇沉淀所得，通過多糖、蛋白含量檢測，得到的3種多糖純度較高，且糖蛋白含量較低。以免疫小鼠模型作為干預對象，結果顯示3種多糖對于環磷酰胺構建免疫缺陷性的小鼠均有一定免疫增強作用。首先3種多糖均可以提高免疫抑制小鼠的脾臟指數和胸腺指數，胸腺是產生T淋巴細胞的主要器官，還可以分泌胸腺素，所以可以直接反映小鼠機體細胞免疫的強弱，而脾臟中有豐富的淋巴細胞和巨噬細胞，2種指數結合可以一定程度上反映免疫功能的強弱[10]，通過對比發現，PW90多糖對于2種指數提高效果較為明顯。在淋巴細胞增殖實驗中，3種多糖均可以促進淋巴細胞的增殖，也可以增強NK細胞的殺傷能力，這證明了樟芝多糖可以改善NK細胞的殺傷作用，對機體的細胞免疫有著很好的增強作用，淋巴細胞亞群的變化也很好地印證了上述細胞免疫增強的結果[11]。在體液免疫方面可以提高血清中IL-2、IL-6和TNF-α的表達，IL-2是T細胞生長因子，活化Th1細胞，促進CTL的增殖，對機體的抗體反應有著重要的作用，IL-6促進T細胞和成纖維細胞產生淋巴因子，增強NK細胞的功能[12]。樟芝多糖對于3者的促表達作用，提高了機體體液免疫功能，所以樟芝多糖對于免疫抑制小鼠的細胞免疫和體液免疫都有很好的調節作用，且PW90效果優于其他2種多糖和總多糖。

綜上所述，本研究分離獲得了3種樟芝多糖均可以提高免疫抑制小鼠的免疫功能，且對于細胞免疫和體液免疫均有增強作用，其中90%乙醇沉淀獲得的多糖效果最佳，但是其確切的組成成分還有待進一步研究。

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