腸上皮細胞緊密連接蛋白的結構功能及其調節

王希 廖呂釗 江榮林

人或動物腸上皮細胞組成了十分重要的機械屏障，對維護完整的腸黏膜屏障功能具有重要意義。相鄰的上皮細胞間通過多種蛋白及分子構成的連接復合體，從頂端到基膜依次為緊密連接（TJ）、黏附連接、橋粒連接和縫隙連接等，共同起著加強細胞間連接功能、組成傳遞信息通道的作用，其中以TJ最為重要。腸上皮細胞TJ與多種腸道疾病的發生、發展以及全身缺血缺氧后出現腸損傷、腸黏膜屏障功能受損等有著密切關系。近年來，關于TJ的功能結構及其影響因素的研究日益增多，本文就腸上皮細胞TJ的蛋白組成、結構功能、調節途徑及其影響因素作一系統闡述。

1 腸上皮細胞TJ功能及結構組成

腸上皮細胞的TJ存在于靠近腸腔側的上皮細胞側面，是一個動態變化的、由多種蛋白及分子組成、具有多種功能的復合體，屬于不通透連接。其功能主要有：（1）連接上皮細胞，封閉細胞間的空隙；（2）維持細胞極性，限制細胞不同液體間的脂質和完整膜蛋白的自由擴散；（3）維持通透性屏障，只能允許離子和可溶性小分子物質通過，限制大分子及微生物通過，并可調節離子和大分子物質跨細胞旁路的被動轉運。構成TJ的蛋白及分子主要包括3種跨膜蛋白，即咬合蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudins）、連接黏附分子（JAM）及閉合小環蛋白（ZOs，一種胞漿蛋白），見圖 1。

圖1 腸黏膜上皮細胞TJ模式圖

1.1 Occludin Occludin有2個亞型，結構特點為經過4次跨膜，形成2個細胞外環。相鄰細胞間Occludin胞外環相互結合，其胞內域的氨基酸殘基富含大量電荷，與ZOs直接結合，再通過胞漿蛋白與骨架蛋白相互作用[1]。Occludin蛋白通過磷酸化來調節TJ復合體的定位及功能，從而影響TJ的滲透性，同時有調節細胞黏附及維持細胞極性等功能。

1.2 Claudins 目前已發現Claudins有26種異構體，聚合于細胞質膜上構成TJ復合物的主鏈，其每一分子均由4個右螺旋折疊結構的跨膜結構域和2個胞外環狀結構組成，這2個環狀結構的第一環大于第二環，有較強的疏水性，且氨基及羧基末端都存在于細胞內，通過PDZ結合域與ZOs分子相連[2]。這2個細胞外環結構是組成TJ的重要結構基礎，且影響著TJ條帶形成及離子選擇通透性。

1.3 JAM JAM有4個異構體，而表達于腸上皮細胞的是JAM-1、JAM-4。與其他TJ跨膜蛋白不同，JAM 家族分子是單次跨膜蛋白，N-端位于細胞膜外并具有2個免疫球蛋白樣環狀結構，即二聚體結構。在腸上皮細胞表面，一個JAM二聚體與相鄰細胞表達的另一個JAM二聚體相互作用，形成一個四聚體，構成JAM間相連的結構[3]，并通過其PDZ結構域與ZOs形成非Ca2+依賴性連接。

1.4 ZOs ZOs蛋白有3種異構體，屬于膜相關鳥苷酸激酶家族。ZOs位于細胞質內膜表面，一端與細胞質內Occludin蛋白末端連接，另一端與TJ和細胞骨架肌動蛋白相連。ZOs對TJ的組成及細胞屏障通透性的維持有著密切的關系[4]。

2 腸上皮細胞TJ的調節途徑

腸上皮細胞TJ作為信號中心，一方面調節細胞外環境與細胞內之間的信息傳遞；另一方面，其本身亦受到細胞內多種信號通路的調節，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、蛋白激酶 C（PKC）、肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）、Rho/Rho激酶、信號轉導及轉錄活化因子 3（STAT3）、Gα12、芳香烴受體（AhR）等，共同調節TJ蛋白的表達，控制TJ蛋白的組裝、分解、磷酸化，影響TJ的結構與功能。

MAPK信號通路主要包括絲裂原活化蛋白（p38）、細胞外調節蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）等2條通路，共同參與TJ蛋白及腸上皮屏障功能的調控[5-6]。蛋白質的磷酸化在TJ的組裝過程中起著重要作用，是維持和調節細胞旁通透性的關鍵，而磷酸化失調可導致TJ功能嚴重受損。PKC能使Occludin、Claudins磷酸化，是TJ重要的調節途徑[7]。促炎細胞因子，如血小板活化因子、IFN、IL-1等，通過激活NF-κB誘導MLCK介導的肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化，細胞質和細胞膜上的ZOs與Occludin蛋白分離，相鄰細胞的間隙增大，從而破壞TJ，增加腸道通透性[8]。有研究發現，抑制Rho活性可導致ZOs和Occludin蛋白在TJ處定位降低；相反，Rho激活后能使ZOs和Occludin蛋白在TJ處沉積，從而維持TJ的功能[1]。Gα12屬于三聚體G蛋白家族，通過SH3結構域結合到ZO-1，Gα12活化能增強TJ蛋白的磷酸化，使TJ蛋白被破壞、Z0-1和Na+-K+-ATP酶的正常分布發生改變，細胞極性消失[9]。STAT3是介導細胞因子信號通路的重要轉錄因子，可與多種細胞因子相結合并通過酪氨酸激酶（JAK）/STAT3途徑發揮誘導細胞信號轉導作用，通過調控基因表達來影響Claudin-1和Occludin 的水平[10]。吲哚并（3，2-B）咔唑-6-甲醛活化 AhR后，通過誘導一系列代謝酶的基因表達，從而影響TJ蛋白ZOs表達及其在上皮細胞間的分布[11]。

3 TJ結構與功能的影響因素

3.1 腸道疾病相關影響 多種腸道疾病的發生，伴隨著腸上皮細胞TJ的損傷、腸屏障結構及功能的破壞，出現病理性改變。

3.1.1 炎癥性腸病 炎癥性腸病包括潰瘍性結腸炎、克羅恩病。在發病時，腸黏膜所產生的大量炎癥細胞因子、炎癥介質等會損傷腸上皮細胞，從而誘導上皮細胞凋亡，并通過多個通路影響腸上皮細胞TJ蛋白的表達及分布，破壞TJ結構，造成腸黏膜屏障功能受損[12-13]。此外，腸上皮細胞TJ結構、蛋白表達和功能異常還被證實參與了乳糜瀉和腸道易激綜合征的發生、發展[14]。在認識到TJ屏障功能受損可引起一系列腸道疾病的基礎上，已有學者開始探索如何增強腸上皮細胞TJ的屏障功能，以減輕和緩解炎癥性腸病的臨床表現。

3.1.2 腸道腫瘤 腸上皮細胞TJ蛋白表達異常，與腫瘤的發生、浸潤和轉移有著密切關系。TJ的完整性遭到破壞，通透性隨之增加，營養因子通過TJ擴散，促進了腫瘤細胞的存活及擴散。TJ的改變對腫瘤的診斷、治療及預后判斷都有著重要的意義，如在大腸癌患者癌組織中腸上皮細胞TJ蛋白中的Claudin-1明顯高于正常組織，其表達狀態與腫瘤的分化、轉移、分期有著密切聯系[15]；同樣，Claudin-3可促進結腸癌的惡性轉化，其機制可能是由表皮生長因子激活ERK1/2等途徑而調控Claudin-3的表達[16]。

3.1.3 腸道感染 細菌引起的腸道感染同樣會影響腸上皮細胞TJ結構及功能。腸道發生致病性大腸桿菌感染時，會改變TJ蛋白Occludin、ZOs及Claudins的分布，破壞腸上皮細胞TJ超微結構，使得TJ的通透性增加[17]?；魜y弧菌能產生一種具有蛋白酶作用的毒素來消化Occludin，從而破壞TJ的完整性。白色念珠菌可通過激活NF-κB、MAPK信號通路來破壞腸上皮細胞TJ蛋白的表達及功能，增加其通透性，影響腸黏膜屏障功能[18]。人類腸道病毒71型是引起手足口病的主要病原體，感染后可使腸上皮細胞TJ蛋白ZOs表達減少，改變TJ的排列，增加TJ通透性，促進病毒及有害毒素的移位[19]。HIV病毒感染時可誘發腸上皮細胞內的NF-κB激活，減少ZO-1表達，進而影響其他TJ蛋白的表達及合成，使得TJ結構完整性遭到破壞，腸黏膜屏障通透性增加[20]。

3.2 缺血再灌注損傷 目前研究已經證實，在多種病理條件下，如膿毒癥、感染性休克、嚴重創傷、腹部手術等引起腸黏膜缺血再灌注損傷，均會導致腸黏膜屏障結構和功能受損。研究發現腸黏膜缺氧會引起腸黏膜炎癥，釋放大量的炎癥因子如 TNF-α、INF-γ、IL-1、IL-6和氧自由基等，這些炎癥因子進一步加重缺氧，造成腸黏膜屏障功能受損[21]。研究發現TNF-α單獨作用即可引起腸黏膜屏障功能損害，其機制可能是通過誘導腸上皮細胞的MLCK蛋白表達，從而引起MLC磷酸化增加及TJ蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1重新分布，最終導致腸黏膜屏障功能損害[22]。

3.3 腸道菌群 健康的人腸道內各種細菌共生，形成了一個動態的微生物區系，當大量外源致病菌入侵腸道或腸道內正常的微生物菌群被破壞時會引起腸道菌群失調，進而通過多種方式破壞TJ，誘導腸上皮細胞凋亡、增加腸上皮細胞間的通透性，進一步促進病原菌、毒素等易位，引發內源性感染。王宏剛等[23]在多黏菌素E誘導腸道菌群失調的研究中發現，各菌群的數量和比例發生明顯變化，雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌受到抑制，腸桿菌、腸球菌等條件致病菌大量繁殖，從而黏附和定植于腸黏膜，破壞并突破腸上皮細胞TJ，導致細菌易位。此外，有研究證明益生菌等對病原菌感染、炎癥性腸病等多種原因引起的TJ破壞及腸黏膜損傷均具有保護與修復作用，其通過直接促進腸上皮細胞TJ蛋白表達或間接通過抑制多種細胞因子如IL-6、IFN-γ、NO等信號傳導通路來調節TJ蛋白表達，進而降低腸黏膜的通透性，阻止病原菌對腸黏膜屏障功能的損傷[24-27]。

3.4 激素影響 目前研究證明，多種激素參與腸上皮細胞的TJ及腸黏膜屏障功能的調節及修復過程。如生長激素（GH）、生長抑素（SST）、腎上腺髓質激素（AM）、糖皮質激素（GCS）、雌激素（EH）等。GH具有明顯促進蛋白質合成的作用，GH受體在腸道吸收細胞、隱窩基底柱狀細胞和腸道內分泌細胞等均有大量分布。研究表明GH可激活MAPK/ERK、MAPK/JNK等通路，調節TJ蛋白磷酸化，進而影響TJ結構及功能[28]。腸上皮細胞是SST重要的靶細胞，表達多種生長抑素受體（SSTR），SST通過與腸上皮的SSTR結合而發揮生物作用，通過抑制MAPK/ERK通路的激活而明顯改善脂多糖引起的腸上皮細胞TJ蛋白表達及分布異常，并增加Occludin、ZOs的表達，改善腸上皮細胞屏障功能[29]。有研究表明，AM可通過下調肌球蛋白輕鏈的磷酸化而調節TJ蛋白表達，從而穩定腸黏膜屏障功能[30]。田鑄等[31]發現在缺氧/復氧條件下，AM可上調TJ蛋白的表達，減輕腸上皮屏障功能的破壞，其機制可能與抑制NF-κB有關。GCS可通過激活GCS受體而抑制腸道炎癥，保護TJ結構與功能的完整[32]。EH通過雌激素受體β（ERβ）上調Occludin和JAM-1的表達，從而降低細胞旁的通透性[33]。

3.5 中醫措施 在我國傳統醫學中，中藥、針灸對腸上皮細胞TJ功能結構的完整以及相關疾病的治療同樣發揮著獨特的作用。有研究發現，健脾清熱活血方藥可能通過增加Claudins的表達來促進腸黏膜修復，以達到緩解潰瘍性結腸炎的效果[34]。翟金海等[35]發現，運用清腸化濕方藥可抑制大鼠結腸組織中TNF-α水平，從而降低對Claudins的破壞，起到治療大鼠結腸炎的作用。Shang等[36]發現在治療克羅恩病患者的過程中，針刺天樞、氣海、足三里、上巨虛等穴位時，可增加TJ中Claudin-1、ZO-1表達，促進TJ結構及功能的修復。

4 總結與展望

腸上皮細胞TJ是構成腸黏膜屏障中機械屏障的重要組成部分之一，對維持腸屏障結構與功能的完整性具有重要意義。隨著對腸上皮細胞TJ的深入研究，尤其是對TJ結構、功能機制以及其影響因素的探索，為感染、腫瘤、炎癥性腸病、缺血再灌注損傷等相關疾病的防治提供了新思路。在傳統醫學中，中藥、針刺相關穴位等對于維持腸上皮細胞TJ功能結構的完整性同樣有著促進作用，從而防治腸上皮細胞間TJ結構功能異常相關疾病。今后在消化系統及危重病的臨床診治中，將有越來越多的措施關注與改善腸黏膜上皮細胞TJ，從而保護腸黏膜屏障功能并改善疾病預后。

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