LC-MS/MS分析血漿中脂肪酸及代謝產物

鐘 宇，陳 濱，李 健，楊青錦，文 娟， 蔡 春

(廣東醫科大學分析中心，廣東 湛江 524023)

花生四烯酸(arachidonic acid, AA)是一種二十碳四烯酸，屬于ω-6多不飽和脂肪酸，AA及其代謝產物在調節新陳代謝、維持機體內環境穩態、調節細胞組織生理功能等方面具有重要作用。脂肪酸的代謝產物單羥基十八碳烯酸(hydroxyoctadecadienoic acids, HODEs)有13-羥基十八碳烯酸(13-hydroxyoctadecadienoic acid, 13-HODE)和9-羥基十八碳烯酸(9-hydroxyoctadecadienoic acid, 9-HODE)兩種異構體。亞油酸(linoleic acid, LA)在非酶促作用下產生等摩爾的13-HODE與9-HODE混合物；在15-脂氧酶作用下，LA氧化產生13-HODE；而在5-脂氧酶作用下，LA氧化產生9-HODE[1-2]。羥基十八碳烯酸在炎癥、代謝綜合征及腫瘤發生過程中具有多重病理生理學作用。Vangaveti等[1]指出9-HODE和13-HODE是不同細胞系統炎癥的主要調節因子，可作為感染免疫狀態的潛在生物標志物[3]。Leghmar等[4]研究表明，在感染人巨細胞病毒(HCMV)的永生化人絨毛外滋養細胞(HIPEC)中釋放13-HODE的量增加，在孕期13-HODE參與炎癥調節和脈管系統的形成。通過吡格列酮刺激可以提高13-HODE的水平，有助于調節脂質代謝和通過調控糖尿病患者的PPAR通路降低患心血管疾病的風險[5-7]。9-HODE和13-HODE在細胞有絲分裂和凋亡中作為程序性細胞死亡過程的調控因子，在維持正常細胞代謝中發揮重要作用，同時也有研究表明，9-HODE和13-HODE與腫瘤的發生發展相關[8-9]。

目前，有關羥基十八碳烯酸的研究主要集中在病理生理學功能，以及其在體內代謝的產生途徑方面，而關于羥基十八碳烯酸分析方法的報道較少。Dumlao等[10]采用LC-MS/MS法檢測細胞中類花生四烯酸；An等[11]采用HPLC法檢測細菌中13-HODE等成分；王秀娟等[12]采用液質聯用法對海帶中的氧化脂類成分進行檢測；Schober等[13]利用GC/MS法檢測了紅細胞中脂肪酸含量。GC/MS法需要樣品衍生化，且不適合分析熱不穩定代謝物；而LC/MS和 LC-MS/MS的前處理方法相對簡單，樣品提取后不需衍生等前處理方法就可以直接上機分析。因此，本研究擬通過優化固相萃取處理技術，采用LC-MS/MS法同時測定血漿中AA、13-HODE和9-HODE，以期為血漿中脂肪酸的代謝研究提供方法參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200-6430A液相色譜-串聯質譜儀：美國Agilent公司產品；3K15臺式高速冷凍離心機：德國Sigma公司產品。

花生四烯酸標準品、13-羥基十八碳烯酸標準品、9-羥基十八碳烯酸標準品、氘代花生四烯酸(arachidonic acid-d8, AA-d8)：美國Cayman Chemical公司產品；乙腈：德國Merck公司產品；實驗用水：由美國Millipore公司的超純水系統制備。

1.2 血漿樣品中脂肪酸及代謝產物的提取和處理

取100 μL血漿，加入1 mL甲醇和10 μL 100 μg/L內標，于4 ℃下攪拌10 min，以13 000 r/min離心5 min，取上清液；用1 mL甲醇和1 mL 0.1%甲酸溶液活化固相萃取柱(Strata-X, 10 mg)，向上清液中添加4 mL 0.1%甲酸溶液，上樣；用1 mL 0.1%甲酸和1 mL 15%乙醇溶液按次序淋洗萃取柱，最后用200 μL甲醇洗脫，收集洗脫液，進行LC/MS分析。

1.3 標準溶液的配制

分別準確量取一定量的AA、13-HODE、9-HODE標準品溶液，用流動相定容，配制成1 mg/L的AA、13-HODE、9-HODE標準儲備液。準確量取一定量的AA-d8內標溶液，用甲醇定容，配制成1 mg/L的AA-d8內標儲備液。儲備液置于-20 ℃保存，使用時用流動相逐級稀釋成混合標準工作液。

1.4 實驗條件

1.4.1色譜條件 BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；流動相：A為水，B為乙腈；流速0.2 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量10 μL；梯度洗脫程序：0～2 min(40%B)，2～20 min(40%～95%B)，20～20.5 min(40%B)。

1.4.2質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，負離子模式；多反應監測模式(MRM)；干燥器溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min；毛細管電壓4 000 V。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

在正、負離子模式下，分別進樣10 μL 1 g/L的AA、13-HODE、9-HODE和AA-d8標準溶液，在m/z50～400范圍內全掃描，以選擇合適的電離模式和準分子離子峰。AA、13-HODE、9-HODE和AA-d8在負離子模式下的響應值較高，示于圖1。在選擇離子監測模式下，優化AA、13-HODE、9-HODE和AA-d8的錐孔電壓，使離子峰強度達到最高；在多反應監測模式下，優化AA、13-HODE、9-HODE和AA-d8的定性和定量離子的碰撞能量，分別選用m/z303.3>259.5、m/z295.3>195.3、m/z295.3>171.2、m/z311.4>267.3作為定量離子。

圖1 AA、13-HODE、9-HODE、AA-d8的全掃描圖(a,c,e,g)和子離子掃描圖(b,d,f,h)Fig.1 Full-scan (a, c, e, g) and product ion (b, d, f, h) mass spectra of AA, 13-HODE, 9-HODE and AA-d8

13-HODE和9-HODE互為同分異構體，其色譜分離特性相似，在液相色譜中難以分離。在優化質譜條件時，由于二者母離子相同，主要對其子離子進行條件優化，選用2個化合物中質荷比不同的子離子作為定量離子。為了監測13-HODE和9-HODE在分析過程中是否相互干擾，在進行13-HODE定量離子MRM分析時，同時監測了9-HODE定量離子m/z295.3>171.2，結果顯示13-HODE的MRM色譜圖中沒有m/z295.3>171.2離子峰。同樣，在進行9-HODE定量離子MRM分析時，同時監測了13-HODE定量離子m/z295.3>195.3，結果顯示9-HODE子離子掃描圖中也沒有m/z295.3>195.3離子峰，故兩者不存在互相干擾。

2.2 色譜條件的優化

為了優化AA、13-HODE、9-HODE在色譜柱上的保留時間和分離條件，探討了流動相中乙腈的比例和流速的影響。在固定流速下，將乙腈比例從30%升至40%，發現AA、13-HODE、9-HODE的響應值升高，峰形變好；將乙腈比例從30%降至20%，或將乙腈比例升至45%、60%時，分離度均有不同程度的降低。在優化梯度洗脫條件下，同時優化了流動相流速，最終選擇1.4.1節中的梯度洗脫程序進行洗脫。在優化條件下，AA、13-HODE、9-HODE、AA-d8標準溶液的色譜圖示于圖2。

圖2 化合物 AA(a)、13-HODE(b)、9-HODE(c)、AA-d8(d)的分離色譜圖Fig.2 Chromatograms of AA (a), 13-HODE (b), 9-HODE (c) and AA-d8 (d)

2.3 樣品前處理條件的優化

本實驗考察了兩種方式淋洗固相萃取柱時的回收率。第一種方式為先分別用0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%甲酸溶液淋洗固相萃取柱，再用15%乙醇溶液淋洗，結果顯示，用0.1%甲酸溶液和15%乙醇溶液淋洗時的回收率最高。第二種方式為先用0.1%甲酸溶液淋洗固相萃取柱，再分別用30%、20%、15%、10%、5%乙醇溶液淋洗，用0.1%甲酸溶液和15%乙醇溶液淋洗時的回收率最高。故選擇0.1%甲酸-15%乙醇溶液作為淋洗液。

2.4 線性范圍、檢出限及定量限

本實驗配制了0.5、1、2、5、10、20、50 μg/L的AA、13-HODE、9-HODE混合標準溶液，各濃度標準溶液的內標濃度均為50 μg/L。在優化的條件下，以定量離子的峰面積對質量濃度繪制標準曲線，在0.5～50 μg/L濃度范圍內，3種脂肪酸代謝物均呈現良好的線性關系，相關系數均大于0.99。以信噪比大于3為樣品的檢出限(LOD)，以信噪比大于10為樣品的定量限(LOQ)，其結果列于表1。

2.5 重復性和精密度

取10 mg/L的AA、13-HODE、9-HODE混合標準溶液，在同一樣品、同一天的3、6、9、12 h和第1、2、3天進行重復測試，連續進樣6次。結果表明：AA、13-HODE、9-HODE日內標準偏差(RSD)分別為6.11%、3.89%和3.72%，日間標準偏差分別為6.39%、4.76%和3.87%，精密度RSD分別為2.77%、1.95%和1.48%。說明該方法的重現性和穩定性較好。

2.6 方法的回收率

向樣品中分別加入200 μL 0.5、5、20 μg/L混合標準溶液，按1.2節方法操作，每個濃度分別連續進樣6次。在不同的加標濃度下，AA的回收率均在98.50%～100.07%之間，RSD在3.7%～5.6%之間；13-HODE的回收率均在97.43%～101.46%之間，RSD在3.6%～5.1%之間；9-HODE的回收率均在97.42%～100.85%之間，RSD在3.8%～4.8%之間，其結果列于表2。

表1 AA、13-HODE和9-HODE的線性方程、相關系數、檢出限及定量限Table 1 Linear equations, correction coefficiencts (R2),limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of AA, 13-HODE and 9-HODE

表2 AA、13-HODE、9-HODE的加標回收率和精密度(n=6)Table 2 Recoveries and precisions of AA, 13-HODE and 9-HODE (n=6)

2.7 實際樣品分析

取6份年齡為50～60周歲的結直腸癌病人血漿，同時采集6份同一年齡段健康人的血漿樣品，按照1.2節方法處理，用LC-MS/MS檢測。樣品中AA、13-HODE、9-HODE的色譜分離圖示于圖3。血漿中AA、13-HODE、9-HODE的含量示于圖4。結果表明，正常組血漿中AA、13-HODE、9-HODE的含量均略高于結直腸癌組。

圖3 實際樣品中13-HODE(a)、9-HODE(b)、AA(c)的分離色譜圖Fig.3 Chromatograms of 13-HODE (a), 9-HODE (b) and AA (c) in the actual samples

圖4 血漿樣品中AA、13-HODE和9-HODE的含量Fig.4 Contents of AA, 13-HODE and 9-HODE in plasma samples

3 結論

通過對血漿樣品進行前處理，建立了LC-MS/MS法分析血漿中脂肪酸代謝產物AA、13-HODE、9-HODE，該方法具有良好的靈敏度、回收率和重現性，適用于血漿中脂肪酸及代謝產物的分析測定。

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