UPLC-HR-MS/MS法對吡唑醚菌酯原藥中主要雜質的定性分析

管陽凡，樊 凱，張金凱，高士杰，鄭錦彪

(上海曉明檢測技術服務有限公司，上海 200335)

吡唑醚菌酯是巴斯夫公司于1993年發現的一種新型甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其化學結構式示于圖1。它不僅廣譜、高效，而且對作物具有保健增產的作用，是美國環保署就此功能登記的第一個產品[1]。自2002年吡唑醚菌酯上市至今，在殺菌劑中它的銷售額穩居前5名[2]。國內對吡唑醚菌酯原藥和復配制劑的研發[3-6]、登記需求也持續高漲，關于吡唑醚菌酯原藥中常見雜質的定性分析已成為關注的熱點。

圖1 吡唑醚菌酯的化學結構式Fig.1 Chemical structure of pyraclostrobin

近幾年，HPLC-MS聯用技術廣泛應用于原料藥的雜質分析中，包括對已知雜質的定量分析和未知雜質的結構解析[7-9]。但對于鑒定結構復雜的化合物，或區分一些同分異構體，LC/MS譜所提供的信息尚不充分，還需要借助MS/MS[10-12]、NMR、IR、X射線衍射等技術，或采用相似化合物譜圖對照[13]的方法進一步分析。高能誘導裂解(higher energy collision induced dissociation, HCD)是一項新型的裂解技術，結合高分辨質譜數據，可用于化合物結構、質譜裂解機理的推測。解析雜質譜圖信息后，通常用雜質對照品進行色譜對照，以便驗證所得結論的準確性。

本實驗擬利用UPLC-MS法分析實驗室合成的吡唑醚菌酯原藥，運用高能誘導裂解質譜(HCD MS/MS)法對原藥中存在的主要雜質進行解析，并通過與對照品比對驗證結論的準確性。希望為吡唑醚菌酯中雜質的定性分析提供方法參考，并為其他甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑中雜質的解析提供方法借鑒。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Acquity UPLC H-Class超高壓液相色譜儀：美國Waters公司產品；Dionex Ultra 3000型超高壓液相色譜儀，Q-ExactiveTM組合型四極桿-高分辨軌道阱質譜儀，Xcalibur工作軟件：美國Thermo-fisher公司產品；十萬分之一天平：德國賽多利斯公司產品。

1.2 主要材料與試劑

乙腈：HPLC級，Tedia公司產品；吡唑醚菌酯原藥：含量≥97%，由實驗室參照文獻[4]的方法合成；實驗用水：Milli-Q超純水。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流動相：A為乙腈，B為超純水；梯度洗脫程序：0～2 min(40%A)，2～12 min(40%～60%A)，12～18 min(60%A)，18～25 min(60%～90%A)，25～30 min(90%A)，30～30.01 min(90%～40%A)，30.01～36 min(40%A)；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL；全波長掃描模式。

1.3.2質譜條件 ESI源正離子模式；質量掃描范圍m/z100～1 000；一級質譜采用全掃描模式，二級質譜采用平行反應監測(parallel reaction monitoring, PRM)模式；噴霧電壓：3.5 kV；離子傳輸管溫度：320 ℃；金屬噴針溫度：300 ℃；鞘氣壓強：241 kPa；輔助氣壓強：69 kPa；碰撞能量：20～50 eV。

2 結果與討論

2.1 液相色譜分析結果

實驗采用Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀進行分析，Dionex Ultra 3000型超高壓液相色譜儀進行雜質對照品比對實驗，液相色譜條件根據國際農藥分析協作委員會發布的吡唑醚菌酯CIPAC方法調整得到。吡唑醚菌酯原藥中主要雜質的UPLC譜圖示于圖2，采用面積歸一法確定各組分的相對百分含量。由于吡唑醚菌酯在190～290 nm波長范圍內均有紫外吸收，本實驗考察了211、254、278 nm 3個波長下雜質的分布，將3個含量大于0.1%的雜質(A、B、C)作為分析對象，其結果列于表1。

2.2 質譜分析結果

2.2.1吡唑醚菌酯的質譜分析 在正離子模式下，吡唑醚菌酯原藥主要成分的質譜圖示于圖3。從同位素峰強度來看，強度最高的m/z388.105 2、410.087 1兩個離子均含有1個氯原子，推測其分別為[M+H]+和[M+Na]+離子，與吡唑醚菌酯正離子的理論分子質量(388.105 9 u)相吻合，一級質譜的誤差為0.7個原子單位。選擇m/z388.105 2為母離子進行HCD MS/MS測定，觀察到4個主要的碎片離子峰m/z296.058 4、194.081 3、164.070 8、163.062 8，推測其質譜裂解途徑示于圖4。

圖2 吡唑醚菌酯原藥中主要雜質的UPLC譜圖Fig.2 UPLC spectra of the main impurities in pyraclostrobin

編號No 保留時間tR/min相對百分含量Relativecontent/%211nm254nm278nm吡唑醚菌酯11 299 13999 21299 233雜質A10 90 1170 1060 108雜質B13 20 1340 1330 137雜質C14 60 1730 1320 179

根據吡唑醚菌酯的相對分子質量推斷各碎片離子的可能結構。由于m/z163.062 8是吡唑醚菌酯有效成分二級質譜中的碎片峰，因此它所含元素種類只可能有C、H、O、N，從數學角度將這4種元素擬合的化學式按照誤差由小到大排列為：C9H9NO2、C7H7ON4、C6H11O5、C5H5N7、C4H9O4N3等。高分辨質譜中，經過質量軸校準后的誤差一般不會超過0.004個原子單位，因此只有前5個擬合結果可能性最大。由于吡唑醚菌酯正離子的化學式為C19H19ClN3O4+，其碎片化學式中C、H、O、N各元素的個數不可能超過母離子，所以第2、3、4個化學式不符合實際情況，而第5個化學式的不飽和度與吡唑醚菌酯本身含多個芳香環的結構特點不符。因此，可以確定m/z163.062 8對應的化學式是C9H9NO2+。同理，可依次推斷另外3個碎片離子m/z296.058 4、194.081 3、164.070 8對應的化學式分別為C16H11ClN3O+、C10H12NO3+、C9H10NO2+。

圖3 吡唑醚菌酯原藥主要成分的一級(a)與二級(b)質譜圖Fig.3 MS (a) and MS/MS (b) spectra of pyraclostrobin

注：圖中各碎片離子的分子質量為理論值圖4 吡唑醚菌酯原藥主要成分可能的裂解途徑Fig.4 Proposed fragmentation pathway of pyraclostrobin

ESI電離源一般是電荷誘導發生的，通常失去中性分子發生電子對的轉移，能夠觀察到偶電子離子。但對于某些化合物，偶電子離子也會丟失1個中性自由基生成奇電子離子[14]。丁友超等[15]在研究4種染料的ESI MS/MS中發現，產生的特征奇電子離子與偶氮、三苯甲烷、蒽醌和硝基苯這4種發色團的誘導裂解有關。這種現象在ESI質譜中已有較多的報道，但目前尚缺乏成體系的理論支持。本實驗中的4個碎片離子均含有奇數個氮原子，一般來說它們的相對分子質量應為偶數，而m/z163.062 8離子的相對分子質量卻為奇數，因此推斷其為奇電子離子，是由某個偶電子離子失去1個自由基得到的。m/z194.081 3與m/z163.062 8相差31.018 5 u，是1個甲氧基自由基的相對分子質量。因此，推測m/z163.062 8是由m/z194.081 3在高能碰撞誘導下裂解失去1個甲氧基自由基后發生電子重排得到的。

圖5 雜質A的一級(a)與二級(b)質譜圖Fig.5 MS (a) and MS/MS (b) spectra of impurity A

2.2.2雜質A的質譜分析 雜質A在正離子模式下的一級質譜圖示于圖5a，圖中可以觀察到m/z358.094 6、380.076 6離子信號，分別為[M+H]+和[M+Na]+離子，其中，m/z358.094 6比吡唑醚菌酯正離子少了30.010 0 u，恰好是1個甲醛(30.010 6 u)的分子質量。選擇m/z358.094 6為母離子進行二級質譜(碰撞能量20 eV)測定，觀察到3個主要的碎片離子峰m/z326.069 1、164.070 6、132.044 5，示于圖5b。雜質A與吡唑醚菌酯有著共同的碎片離子m/z164.070 6，但沒有m/z194.081 3碎片，說明雜質A與主成分的氨基甲酸酯部分可能相同，但又缺失了氨基上的甲氧基。因此，推測雜質A可能的裂解途徑示于圖6。雜質A的裂解途徑有2種可能：一種是先失去1分子甲醇后得到m/z326.069 1的中間過渡態，經過電子重排后得到更穩定的共軛結構；另一種是直接失去1分子對氯吡唑醇，得到與吡唑醚菌酯相同的碎片離子m/z164.070 6。

2.2.3雜質B的質譜分析 雜質B在正離子模式下的質譜圖示于圖7，圖7a中m/z436.082 0、458.063 8離子信號分別為[M+H]+和[M+Na]+離子。選擇m/z436.082 0為母離子進行MS/MS測定(碰撞能量20 eV)，產生4個主要的碎片離子峰m/z296.058 5、 242.057 9、212.047 3、163.062 9，同時還有m/z356.077 2、63.000 3等強度相對較弱的特征碎片峰，示于圖7b。通過雜質B分子離子峰的同位素比，發現其含有2個氯原子，比吡唑醚菌酯分子質量多47.977 1 u，即1個氯甲烷的分子質量；二級質譜圖中觀察到的m/z63.000 1碎片峰與氯乙烷ClCH2CH2+碎片的精確理論分子質量相吻合。這是因為在合成吡唑醚菌酯反應過程中使用了二氯乙烷為反應溶劑?；谝陨闲畔?，推測雜質B的結構可能是氯乙基取代了吡唑醚菌酯的1個甲基。通過二級質譜圖中的m/z356.077 2、296.058 5碎片峰，推測雜質B與吡唑醚菌酯分子的氨基甲酸酯部分可能相同，其可能的裂解途徑示于圖8。其中，碎片離子m/z163.062 8是由m/z242.057 9失去1個氯乙氧基自由基后重排得到的奇電子離子，該雜質可能是羥胺中間體與二氯乙烷溶劑在堿性環境下發生取代反應脫去1分子氯化氫的產物。

2.2.4雜質C的質譜分析 雜質C在正離子模式下的質譜圖示于圖9，圖9a中m/z466.015 9、487.997 8離子信號分別為[M+H]+和[M+Na]+離子。選擇m/z466.015 9為母離子進行MS/MS測定(碰撞能量20 eV)，產生了4個主要的碎片離子m/z355.071 7、194.081 3、164.070 6、163.062 8，示于圖9b。從圖9a可以看出，雜質C分子結構中含有多個鹵原子，比吡唑醚菌酯的分子質量多77.911 2 u，即1個Br的原子質量。因此，推測雜質C的結構可能為吡唑醚菌酯的1個H原子被Br原子取代。

圖6 雜質A可能的裂解途徑Fig.6 Proposed fragmentation pathway of impurity A

圖7 雜質B的一級(a)與二級(b)質譜圖Fig.7 MS (a) and MS/MS (b) spectra of impurity B

從合成路線分析Br原子的位置，有2種可能性，示于圖10。一種可能性是芐基溴化的步驟中發生了二溴化副反應，芐基上有2個H原子被Br原子取代，繼續反應，其中1個Br原子被1-(4-氯苯基)-1H-3-吡唑醇取代，而另1個Br原子則保留在芐基上，這種解釋更符合合成理論的預期；另一種可能性是Br原子取代了吡唑環上的4號位H，其來源是芐溴化反應中過量的Br被帶入到了下一步反應，直接與吡唑醚菌酯發生了溴化反應。

進一步分析雜質C的二級質譜圖，發現其含有與吡唑醚菌酯相同的主要碎片離子m/z194.081 3、164.070 6，說明雜質C與吡唑醚菌酯分子的甲氧基氨基甲酸酯部分可能是相同的，m/z194.081 3碎片是雜質C失去1分子溴代1-(4-氯苯基)-1H-3-吡唑醇得到的，由此推測Br原子可能位于吡唑醇片段上。綜合質譜和合成路線分析的結果，雜質C的結構可能是吡唑醚菌酯吡唑環被溴化的產物(圖10中可能性2)，由此進一步推測雜質C可能的裂解途徑，示于圖11。其中，m/z355.070 6是一個奇電子離子。

圖8 雜質B可能的裂解途徑Fig.8 Proposed fragmentation pathway of impurity B

圖9 雜質C的一級(a)與二級(b)質譜圖Fig.9 MS (a) and MS/MS (b) spectra of impurity C

2.3 雜質對照品的比對與確認

根據以上由質譜和合成路線推測的雜質結構，經過實驗室合成得到雜質對照品，將對照品的保留時間、質譜信息與原藥中的雜質對比，結果列于表2。結果表明，合成的雜質對照品與原藥中雜質的保留時間、質譜圖一致，說明質譜分析結果準確可靠。

3 結論

本工作應用UPLC-MS和HCD MS/MS技術分析了實驗室合成的吡唑醚菌酯原藥中3個主要雜質。結果表明，在吡唑醚菌酯以及雜質B、C的HCD質譜中，同時存在著偶電子離子和奇電子離子。結合原藥合成路線推測出3個雜質可能的結構：雜質A產生于硝基羥胺化還原步驟中；雜質B由羥胺中間體與二氯乙烷溶劑反應產生；雜質C是芐溴化反應步驟中過量的溴導致的。由此可見，在吡唑醚菌酯原藥的工藝改進活動中，控制羥胺化、溴化兩個步驟中的副反應，有助于提升原藥的質量。

圖10 雜質C生成的2種途徑Fig.10 Two possible formation pathways of impurity C

圖11 雜質C可能的裂解途徑Fig.11 Proposed fragmentation pathway of impurity C

保留時間tR/min一級質譜MS(m/z)二級質譜MS/MS(m/z)原藥中雜質A10 65358 0946326 0691，164 0706，132 0445雜質A對照品10 67358 0941326 0690，164 0706，132 0445原藥中雜質B12 80436 0820296 0585，242 0579，212 0473，163 0629雜質B對照品12 88436 0812296 0587，242 0576，212 0471，163 0627原藥中雜質C14 26466 0159355 0717，194 0813，164 0706，163 0628雜質C對照品14 31466 0152355 0708，194 0808，164 0702，163 0624

參考文獻：

[1] 陳雨,張愛芳,夏本勇,等. 吡唑醚菌酯對大豆炭疽病防效及保健增產作用[J]. 農藥,2011,50(9):697-699.

CHEN Yu, ZHANG Aifang, XIA Benyong, et al. Efficacy of pyraclostrobin in controlling soybean anthracnose and theireffects on the health protection and yield increase[J]. Agrochemicals, 2011, 50(9): 697-699(in Chinese).

[2] 張梅鳳,呂秀亭. 2011年-2015年專利到期的農藥品種之吡唑醚菌酯[J]. 今日農藥, 2012, (8): 36-38.

ZHANG Meifeng, LV Xiuting. Patent expired pesticide during 2011-2015: pyraclostrobin[J]. Current Pesticide, 2012, (8): 36-38(in Chinese).

[3] 陶賢鑒,羅亮明,黃超群,等. 吡唑醚菌酯的合成研究[J]. 農藥研究與應用,2009,13(1):16-21.

TAO Xianjian, LUO Liangming, HUANG Chaoqun, et al. Synthesis of pyraclostrobin[J]. Agrochemicals Research & Application, 2009, 13(1): 16-21(in Chinese).

[4] 李清,李巍,劉東志,等. 吡唑醚菌酯的合成研究[J]. 化學工業與工程,2016,33(1):45-50.

LI Qing, LI Wei, LIU Dongzhi, et al. Synthesis of pyraclostrobin[J]. Chemical Industry and Engineering, 2016, 33(1): 45-50(in Chinese).

[5] 馬海軍,曹慶亮,馬亞芳,等. 吡唑醚菌酯的合成和初步生物活性[J]. 農藥,2013,52(6):408-410.

MA Haijun, CAO Qingliang, MA Yafang, et al. Synthesis and biological activities of pyraclostrobin[J]. Agrochemicals, 2013, 52(6): 408-410(in Chinese).

[6] 楊麗娟,柏亞羅. 甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑-吡唑醚菌酯[J]. 現代農藥,2012,11(4):46-50.

YANG Lijuan, BAI Yaluo. Strobilurin fungicide-pyraclostrobin[J]. Modern Agrochemicals, 2012, 11(4): 46-50(in Chinese).

[7] 陳海燕,陶文波,丁克鴻. 液質聯用分析嘧菌酯合成中的副反應[J]. 農藥,2016,(10):725-728.

CHEN Haiyan, TAO Wenbo, DING Kehong. Analysis of side reactions in the synthesis of azoxystrobin by LC/MS[J]. Agrochemicals, 2016, (10): 725-728(in Chinese).

[8] 王金秋,馬建民,夏曦,等. 超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定豬肌肉中13種喹諾酮藥物殘留[J]. 質譜學報,2014,35(2):185-192.

WANG Jinqiu, MA Jianmin, XIA Xi, et al. Determination of 13 quinolone antibiotic residues in swine muscle by UPLC MS/MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2014, 35(2): 185-192(in Chinese).

[9] 周建良,周哲,陳碧蓮,等. UHPLC/LTQ Orbitrap MS法解析一種未知西地那非衍生物[J]. 質譜學報,2016,37(5):422-430.

ZHOU Jianliang, ZHOU Zhe, CHEN Bilian, et al. Identification of an unknown derivative of sildenafil by UHPLC/LTQ Orbitrap MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2016, 37(5): 422-430(in Chinese).

[10] 王子健,劉穎,劉思燚,等. UPLC-HRMSn結合高能誘導裂解快速鑒定麥冬中高異黃酮類成分[J]. 質譜學報,2016,37(6):481-491.

WANG Zijian, LIU Ying, LIU Siyi, et al. Rapid identification of homoisoflavonoids in ophiopogon japonicas based on UPLC-HRMSncombined HCD method[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2016, 37(6): 481-491(in Chinese).

[11] 王敏,張海燕,楊金良,等. 磺胺類藥物電噴霧質譜高能裂解規律[J]. 溫州醫學院學報,2013,43(10):642-646.

WANG Min, ZHANG Haiyan, YANG Jinliang, et al. Research on fragmentation pathways of sulfonamide by ESI high energy collision induced dissociationtechnique[J]. Journal of Wenzhou Medical College, 2013, 43(10): 642-646(in Chinese).

[12] GODFREY A R, WILLIAMS C M, DUDLEY E, et al. Investigation of uremic analytes in hemodialysate and their structural elucidation from accurate mass maps generated by a multi-dimensional liquid chromatography mass spectrometry approach[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2009, 23(19): 3 194-3 204.

[13] HOSSEINI S E, SAEIDIAN H, AMOZADEH A, et al. Fragmentation pathways and structural characterization of organophosphorus compounds related to the chemical weapons convention by electron ionization and electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2016, 30(24): 2 585-2 593.

[14] KARNI M, MANDELBAUM A. The even electron rule[J]. Organic Mass Spectrometry, 1980, 15(2): 53-64.

[15] 丁友超,楊安南,蔡建和,等. 官能團對染料在電噴霧串聯質譜中的離子化和裂解行為的影響[J]. 質譜學報,2009,30(6):340-345.

DING Youchao, YANG Annan, CAI Jianhe, et al. Effects of functional groups on ionization andfragmentation of dyestuffs by ESI-MS/MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2009, 30(6): 340-345(in Chinese).