裸藻遺傳轉化技術的研究進展

邵 青 蔣永光 雷安平 胡章立 王江新

(1. 深圳大學生命與海洋科學學院， 深圳市海洋生物資源與生態環境重點實驗室， 深圳 518060；2. 中國地質大學(武漢)環境學院生物科學與技術系， 武漢 430074)

裸藻(Euglena)是單細胞的真核藻類， 沒有細胞壁， 外側由原生質膜包裹， 頂端生有鞭毛， 可以自由游動。裸藻細胞具有完整葉綠體， 在光下能夠通過光合作用進行自養生長， 在無光照的條件下也可以利用外界有機物進行異養生長[1]。由于細胞具有感光的眼點結構， 在原生動物學研究中又稱為“眼蟲”；分子系統學的研究也表明， 裸藻與致病性寄生蟲錐蟲(Trypanosomes)和利士曼原蟲(Leishmania)具有較近的親緣關系[2]。因此， 裸藻具有植物和動物的雙重特性。裸藻細胞核具有間核性質， 在細胞分裂過程中， 核膜和核仁均不消失， 染色體保持濃縮狀態， 是一種介于真核和原核之間的類型。裸藻的葉綠體由兩層葉綠體膜和一層內質網膜包圍， 這種三層膜結構表明裸藻葉綠體起源于內共生的原始綠藻[3]。與其他具有葉綠體的藻類或高等植物不同，裸藻葉綠體穩定性較差， 在抗生素等脅迫條件下易丟失[4]。因此， 裸藻具有獨特的細胞結構和生物學地位， 是研究真核生物進化和葉綠體內共生的良好材料， 具有重要的科研價值。

纖細裸藻(Euglena gracilis)是裸藻屬中研究最多的一個模式種， 細胞呈橢球狀或球狀， 形態可變，長31—40 μm， 寬9—14 μm。纖細裸藻細胞富含多種維生素、氨基酸和多不飽和脂肪酸， 具有很高的營養價值[5]。2013年10月， 國家衛生和計劃生育委員會發布公告， 批準裸藻等作為新食品原料。裸藻生長過程中能夠積累大量的副淀粉(Paramylon)作為能量貯藏物質， 占到裸藻干重的50%—90%[6，7]。副淀粉是一種β-1，3-葡聚糖， 具有增強免疫力[8]、抗過敏[9]、抗病毒[10]和抗腫瘤[11，12]活性。在黑暗厭氧條件下， 裸藻細胞能夠將副淀粉分解轉化成蠟酯，而蠟酯具有廣泛的工業用途， 并可以用來生產生物燃料[13，14]。因此， 纖細裸藻不但是一種高附加值的保健食品， 也是潛力巨大的生產生物能源的重要原料， 具有重要的經濟價值。

目前， 裸藻的生物學研究主要集中在細胞生理、酶學特征、基因克隆等方面[15—19]， 對裸藻遺傳轉化的研究和應用極少， 制約了裸藻遺傳學和裸藻生物技術的發展。文章結合作者所在課題組的研究工作， 以纖細裸藻為例， 對已有的裸藻遺傳轉化方法及其存在的問題進行了綜述， 并對未來的研究進行了展望。

1 纖細裸藻的基因組序列及系統生物學信息

纖細裸藻含有細胞核、葉綠體、線粒體3套基因組。裸藻基因組巨大而且具有高度復雜的序列結構和高比例的重復序列， 測序拼接的難度極大[20]，經過3年多的努力本課題組已經率先完成纖細裸藻野生型藻株Z的基因組草圖， N50 contig已達150 kb，并已初步確認纖細裸藻基因組約3.3 G， 此結果經過各種方法證實， 遠大于模式生物萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的124 M[21]、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的27.4 M[22]、團藻(Volvox carteri)的138 M[23]、小球藻(Chlorella variabilis)的46 M[24]； 其含有45%左右的重復序列， 給二代三代測序相結合的基因組組裝造成了很大的困難， 該基因組草圖的報告已經投稿； 另外， 通過本課題組獲得的裸藻轉錄組和蛋白組， 發現不同尋常多的非編碼RNA， 完成40128個基因的鑒定及功能注釋； 其特殊復雜的間核結構、染色體組型以及基因組3D-STORM掃描、基因組的精細作圖也正在進行。目前英國有實驗室也正在組裝該藻株的基因組， 他們的最新網站公開結果[EuglenaDB， https://sites.dunde-e.ac.uk/euglenadb/]表明裸藻的基因組大小(1.43 G)， N50為0.9 kb， 此結果與本課題組測序組裝結果存在較大差異。每個裸藻細胞中含有約10個葉綠體[25]， 而每個葉綠體中含有200—600個基因組拷貝[26]， 葉綠體基因組與原核生物類似， 呈環狀結構， 大小約143 kb， 編碼87個已知的基因， 在基因內部至少含有149個內含子[27]。線粒體基因組為線性結構， 包含多個5—8 kb的線性片段， 編碼7個呼吸鏈復合物蛋白， 包括3個復合物Ⅰ亞單位(分別由nad1、nad4、nad5編碼)， 1個復合物Ⅲ亞單位(由cob編碼)， 以及3個復合物Ⅳ亞單位(分別由cox1、cox2、cox3編碼)； 另外， 線粒體內還含有一些小的未知功能的基因片段， 可能與DNA重組和RNA修飾有關[28]。

裸藻的de novo轉錄組在不同培養基培養下的初步研究已見報道[29，30]， 但其他組學數據包括蛋白組、小RNA組和甲基化組尚未見有報道。本課題組針對裸藻的葉綠體進化及細胞核-葉綠體的分子通信方面， 在不同的分子層面， 包括轉錄組、蛋白組、代謝組還有甲基化組進行了全面的數據收集，相關的文章在整理撰寫當中； 與此同時， 在綠色裸藻里存在著黑暗處理條件下預光照1.5h可以消除從黑暗到光照下轉換過程中長達12h的葉綠體分化延遲， 本課題組也在通過轉錄組試圖探求其內在的調控機理； 而鑒于裸藻介于動植物的生物特性， 也在研究其microRNA全基因組信息， 及其microRNA在裸藻細胞光響應中的作用； 另外， 本課題組正在利用最新的單細胞分析技術， 同時解析4000—6000多個纖細裸藻在黑暗培養條件下添加甲基化酶抑制劑中約15%的細胞葉綠體分化的多態性問題?？傊?， 通過各種組學分析， 本課題組已經獲得了一批跟葉綠體分化、葉綠體與細胞核分子通信相關的可能性關鍵基因和非編碼小RNA， 也提出了幾個新的假說理論， 急需一個高通量、高效的基因工程技術方法來進行功能驗證。

2 纖細裸藻的抗生素耐受性和篩選標記

本課題組對纖細裸藻的抗生素耐受性進行了詳細檢測， 發現10 μg/mL以上的遺傳霉素(G418)和博來霉素(Zeocin)就可以顯著抑制裸藻細胞的生長，而巴龍霉素、潮霉素、卡那霉素、四環素以及除草劑(草銨膦)在30 μg/mL時對裸藻細胞仍沒有明顯抑制作用， 用更高濃度(＞ 100 μg/mL)的卡那霉素和巴龍霉素也可以顯著抑制裸藻生長， 說明裸藻對多數抗生素和除草劑具有較強的耐受性， 但對G418和Zeocin較為敏感。

G418是一種氨基糖苷類抗生素， 其結構與巴龍霉素、卡那霉素相似， 通過干擾核糖體功能而阻斷蛋白質合成， 對細菌和真核生物細胞都有毒性。在細胞轉染中， 常用氨基糖苷磷酸轉移酶基因(neo)作為篩選標記， 該酶催化G418的磷酸化失活， 使細胞獲得抗性。目前還沒有用G418篩選裸藻的報道， 但已有文獻使用了巴龍霉素進行裸藻突變株篩選， 并用新霉素磷酸轉移酶基因(NPTII)作為抗性標記[31]。

Zeocin是爭光霉素家族的一種糖蛋白抗生素，能夠降解細胞內的DNA， 對原核和真核細胞具有廣泛的抑制作用。在萊茵衣藻的轉化中， 采用來源于細菌Streptoalloteichus hindustanus的ble基因可以賦予藻細胞對Zeocin的抗性[32]， 該基因編碼13.5 kD的蛋白， 能夠與Zeocin結合抑制其活性[33]。在裸藻細胞內， 也有利用ble基因轉化和Zeocin篩選的報道[34]。此外， 文獻還報道了用aadA基因轉化裸藻， 并用鏈霉素和壯觀霉素篩選陽性轉化子[35]，aadA基因編碼氨基糖苷腺苷酸轉移酶， 能夠將ATP的腺嘌呤基團轉移到抗生素分子上使其失活。

本實驗室在利用基因槍方法轉化含ble和NPTII的線性化質粒實驗中， 得到了帶有抗性的裸藻細胞單克隆， 它們分別能在含80 μg/mL Zeocin和250 μg/mL巴龍霉素的液體CM培養基中生長， 并且也能在同樣抗生素濃度的固體平板上穩定生長和傳代， 而野生型裸藻細胞在此抗生素濃度的培養基中是不能存活并傳代的。

3 外源基因導入裸藻細胞的方法

除裸藻外， 萊茵衣藻等真核微藻的遺傳轉化體系已經有了較為系統的研究， 建立了多種轉化方法，包括基因槍(Biolistic)、電穿孔(Electroporation)、農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導， 以及玻璃珠研磨法(Glass beads)。

3.1 基因槍法

基因槍是通過高壓氣流將包被了DNA的微粒轟擊進入細胞， 是目前最有效的轉化方法之一， 其不受細胞類型的限制， 在轉基因研究中應用廣泛。該方法已經用于萊茵衣藻[36]、三角褐指藻[37]、杜氏鹽藻(Dunaliella salina)[38]、擬微綠球藻(Nannochloropsis)[39]、團藻[40]， 以及裸藻近緣種錐蟲[41]的轉化。另外， 基因槍法可以高效地將外源基因導入細胞器， 例如， Boynton等[42]將野生型衣藻的atpB基因轟擊到3株衣藻葉綠體atpB突變株中， 使其恢復了光合作用能力； Hu等[43]將抗性基因ble轟擊到衣藻線粒體并穩定表達。

Doetsch等首先將Sanford等建立的基因槍法[44]進行改進， 并用于纖細裸藻的轉化[35]， 主要步驟為:收集異養條件下生長到對數末期的裸藻細胞， 通過低壓真空抽濾平鋪到濾膜上(直徑45 mm， 孔徑0.22 μm)， 形成細胞薄層， 將濾膜轉移到異養平板上， 2h內完成轉化。用2.5 μg的質粒DNA包被M5型的鎢粉顆粒， 用DuPont PDS-100/He型基因槍和7600 kN/m2的破裂膜， 設置3.4 kPa的真空度和12.3 cm的靶向距離， 對裸藻細胞進行一次轟擊后， 將濾膜轉移到篩選平板上， 約6周后挑取轉化子。

Ogawa等[45]為了提高裸藻轉化效率， 對基因槍轉化的流程做了進一步改進， 如圖 1所示， 主要步驟為: 離心收集對數生長期的纖細裸藻細胞， 用無菌水清洗后重懸， 用低壓真空抽濾將細胞平鋪到濾膜上， 將濾膜放置于CM培養基平板， 黑暗過夜。將0.25 μm的金納米顆粒懸浮于100 μL無菌水， 加入6 μg的DNA， 100 μL 2.5 mol/L CaCl2， 40 μL 0.1 mol/L亞精胺， 4℃混合20min使DNA與金顆粒充分結合。用Bio-Rad PDS-1000/He型基因槍和900 psi的破裂膜， 設置9 cm的靶向距離， 對裸藻細胞進行一次轟擊后， 用2 mL CM培養基洗下藻細胞， 光照復蘇過夜后再涂布于篩選平板， 培養直至獲得轉化子。

圖 1 基因槍法轉化裸藻的流程Fig. 1 The procedure of biolistic transformation of E. gracilis

3.2 電穿孔法

電穿孔是利用高壓電場擊穿細胞膜， 瞬時提高膜的通透性， 外源核酸或蛋白分子在電場作用下擴散進入細胞。由于電穿孔技術操作簡單、成本低，對細胞損傷程度小， 是細胞轉化時優先選擇的轉化方法。在微藻研究中， 電穿孔技術具有比基因槍法更高的轉化效率， 但針對細胞器的轉化研究較少。萊茵衣藻[46]、小球藻[47]、三角褐指藻[48]、杜氏鹽藻[49]、擬微球藻[50]， 以及衣藻近緣種錐蟲和利什曼原蟲[51]均已經建立了穩定的電穿孔轉化方法。

Krajcovic等[34]報道了利用電穿孔技術將ble基因導入裸藻細胞， 但并未描述電擊的條件。Iseki等參照錐蟲的電穿孔條件， 進行改進后， 成功將雙鏈RNA(dsRNA)分子導入裸藻細胞[52，53]， 主要步驟為:收集黑暗培養兩天的裸藻細胞， 用無機鹽培養基重懸， 取90 μL藻液(含有1×106細胞)轉入0.4 cm間隙的電擊杯， 加入RNA溶液混合， 用Bio-Rad Gene Pulser II電轉儀， 設置電擊參數為1.2 kV和25 μF， 室溫放置30min后再接種到新鮮培養基中。Ishikawa等[54]將電壓降到0.5 kV后仍然能夠將dsRNA導入裸藻細胞， Nakazawa等[55]則將400 μL藻液(含有4×106細胞)轉入0.2 cm間隙的電擊杯， 使用BTX-ECM60型電轉儀， 設置電擊參數為0.5 kV和200 μF。

Ohmachi等[56]建立了裸藻單細胞電穿孔技術，即利用連接注射器的細口徑微量吸管， 通過負壓吸附固定單個裸藻細胞， 在吸管內置入電極和綠色熒光蛋白(GFP)等熒光探針， 施加方波電場成功將熒光探針注入單個裸藻細胞， 該方法所用電壓較小為5—20 V， 脈沖時間為30—500 ms， 頻率為1—5 Hz，持續時間為1—5s。

3.3 農桿菌介導法

土壤農桿菌能夠自然地感染植物細胞， 并將其Ti質粒上的一段T-DNA插入到植物基因組中， 研究人員利用這一原理建立了農桿菌介導的轉化方法[57]，并廣泛應用于高等植物的基因工程研究。目前， 在萊茵衣藻[58]、小球藻[59]、雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)[60]、杜氏鹽藻[61]、擬微球藻[62]等微藻中也已經建立了農桿菌介導的轉基因方法。日本研究者利用農桿菌介導將Zeocin、G418以及潮霉素的抗性基因導入裸藻細胞， 并在抗性轉化子的基因組和轉錄組中檢測到了相應的抗性基因， 該方法已經申請了專利[63]。

3.4 玻璃珠研磨法

Kindle[64]報道了通過玻璃珠研磨， 將ble基因導入細胞壁缺陷的萊茵衣藻， 獲得了較高的轉化效率。由于裸藻細胞沒有細胞壁， 作者嘗試用玻璃珠研磨法將含有NPTⅡ基因的pRI101-AN質粒導入纖細裸藻， 并用巴龍霉素篩選， 多次重復實驗也沒有獲得陽性轉化子， 推測原因是裸藻原生質膜結構堅韌， 難以通過研磨法形成有效穿孔。

4 裸藻的遺傳轉化

4.1 細胞核轉化

Krajcovic等[34]首先報道了裸藻細胞核轉化的方法， 將基因ble克隆到裸藻捕光色素復合體Ⅱ基因(lhcpII)的5′和3′末端之間， 使其受到lhcpII啟動子的調控表達， 將該表達序列通過電穿孔或者基因槍轉入裸藻細胞并在Zeocin平板上篩選， 所得轉化子能夠檢測到ble基因， 并且可以穩定保存一年以上。

藍細菌FBP/SBPase是同時具有果糖-1，6-二磷酸酶和景天庚糖-1，7-二磷酸酶活性的雙功能酶，Ogawa等將FBP/SBPase與番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(RbcS)的轉運肽構建成融合蛋白， 用于葉綠體定位， 并將其表達框架克隆至植物表達載體pRI101-AN， 受到CaMV 35S啟動子和NOS終止子的調控， 用基因槍將該重組質粒轉入裸藻細胞，在巴龍霉素平板上得到的陽性轉化子中能夠檢測到FBP/SBPase基因序列， 在轉化子的葉綠體中也能檢測到FBP/SBPase蛋白， 轉化子在高光和高CO2條件下的光合效率， 以及裸藻副淀粉的積累量都顯著提高[31]。作者采用該文獻的方法， 單獨用pRI101-AN線性化質粒轉化裸藻細胞， 所得轉化子能夠長期保持巴龍霉素抗性， 但在基因組和轉錄組中均未檢測到抗性基因NPTII， 分析原因可能是裸藻本身能夠產生較強的抗生素耐受性， 因此， 陽性轉化子需用多種方法進行鑒定。

4.2 葉綠體轉化

Doetsch等[35]將aadA基因克隆到光系統II核心蛋白基因psbA的5′和3′末端之間， 使其受到psbA啟動子的調控， 用基因槍將含有該表達框架的載體導入裸藻葉綠體， 并在含有高濃度鏈霉素和壯觀霉素的平板上篩選轉化子。由于鏈霉素和壯觀霉素會抑制葉綠體蛋白質合成， 導致葉綠體發育受阻和藻細胞褪色凋亡， 只有導入了aadA基因并有效表達的轉化子才能夠保持綠色生長狀態。根據這一表型，Doetsch等[41]獲得了若干陽性轉化子， 在其葉綠體中能夠檢測到aadA基因， 但該DNA片段并沒有整合到葉綠體基因組上， 而是以游離元件的形式存在于葉綠體基質， 并保持了較低水平的表達。Doetsch等[41]還將含有葉綠體同源重組片段的載體導入到裸藻細胞中， 也取得了類似的結果。此外， 在錐蟲的轉化中也發現了這種外源載體以游離元件形式存在的現象[41]。由于裸藻的遺傳背景尚不清楚， 外源載體在葉綠體內復制并穩定遺傳的現象還無法解釋。

5 RNA干擾技術在裸藻細胞內的應用研究

RNA干擾(RNAi)是由dsRNA誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象， 這是生物體內存在的一種基因表達的調控方式。利用這一機制， 可以人為構建目的基因的同源dsRNA， 導入細胞后實現特定基因的表達抑制。Iseki等[52]首次在裸藻中使用了RNAi技術來研究核基因的功能， 利用電轉化將裸藻藍光受體―光敏化腺苷酸環化酶(PAC)的同源dsRNA導入裸藻細胞， 顯著降低了細胞內PAC的含量， 并且在細胞分裂幾代之后依然有效。隨后，RNAi技術在裸藻的基因功能驗證中得到廣泛應用，表 1展示了到目前為止利用RNAi技術在裸藻中開展的基因功能研究， 這些基因涉及裸藻的基本代謝、光響應、代謝物合成等各個方面。在這些文獻中用到的導入DNA、基因克隆的方法等加以優化后可用于裸藻的遺傳轉化研究。

表 1 利用RNAi技術的裸藻基因功能研究Tab. 1 RNAi-based study of gene function of Euglena

6 問題與展望

裸藻獨特的生物學特征使其具有重要的科研價值和經濟價值， 但是無論遺傳學研究， 還是工業化應用， 都離不開成熟的基因工程手段。國際上只有少數實驗室開展了裸藻遺傳轉化的研究， 而且正式發表的文章數目極少。作者所在實驗室對裸藻的遺傳轉化體系開展了較長時間的研究， 發現裸藻的穩定轉化存在以下問題: (1)裸藻細胞在抗生素作用下容易產生較強的耐受性， 導致篩選失??； (2)外源DNA導入細胞后可能以游離形式存在， 不能實現基因組的插入突變， 而且外源DNA在細胞內的復制機理也不清楚。根據對文獻資料的總結和分析， 作者認為裸藻的遺傳轉化有以下幾個研究方向: (1)裸藻基因組測序完成后， 細胞核內外DNA的復制機制有待闡明； (2)通過使用高表達的啟動子、密碼子優化和內含子嵌入等多種方式構建更為高效的裸藻篩選標記， 以及多種用途的工具載體； (3)建立裸藻線粒體轉化體系， 開展線粒體遺傳特征的研究；(4)對CRISPR/Cas9、Cpf1等基因編輯工具(裸藻中尚未報道)進行優化后， 應用于裸藻的遺傳改造。今后， 隨著遺傳轉化體系的完善， 裸藻的基礎生物學研究將會取得較大進展， 基因工程改造也將極大地促進裸藻的工業化應用和規?；a。

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