基于形態學差異探討秦嶺細鱗鮭亞種有效性問題

蒙彥曉 王桂華 熊冬梅 劉海俠 張建祿 王繼隆 王立新 劉小林

(1. 西北農林科技大學動科學院水產科學教研室， 楊凌 712100； 2. 陜西省動物研究所， 西安 710032；3. 中國水產科學研究院黑龍江水產研究所， 哈爾濱 150070)

細鱗鮭屬魚類(Brachymystax)簡稱細鱗鮭， 隸屬于鮭形目(Salmoniformes)、鮭科(Salmonidae)， 典型的冷水性魚類， 又稱為江細鱗、山細鱗(東北地區)[1]， 五色魚(陜西)， 梅花魚(甘肅)等[2，3]。該屬物種主要分布在西伯利亞東部、蒙古北部、中國北方及韓國等地[4]， 在我國呈點狀不連續分布， 秦嶺是其分布的最南端[5]。細鱗鮭在秦嶺地區主要分布于陜西黑河、胥水河、石頭河和太白河等山區溪流以及甘肅的渭水支流上游。由于過度捕撈、水域污染和生境破壞等因素， 秦嶺細鱗鮭野生種群數量銳減， 早在1998年已列為國家Ⅱ級重點保護野生動物[6]。近年來， 細鱗鮭作為一種重要的資源保護物種和養殖潛力巨大的冷水性經濟魚類， 引起了國內外學者的廣泛關注[7—13]。然而， 關于秦嶺細鱗鮭的亞種分類地位有效性問題一直存在爭議， 一種學術觀點認為秦嶺地區的細鱗鮭(Brachymystax lenok tsinlingensisLi， 1966)有別于分布在新疆和黑龍江地區的細鱗鮭[B. lenok lenok(Pallas， 1773)]， 被認為是一個新亞種[5，6，14，15]； 另一種觀點則認為細鱗鮭在我國不存在亞種分化[2，16，17]。此外， 分布于黑龍江流域的細鱗鮭依據吻部特征被細分為鈍吻細鱗鮭(B. tumensisMori， 1930)和尖吻細鱗鮭(Brachymystax lenok)[18—22]， 且鈍吻細鱗鮭形態特征更接近于秦嶺細鱗鮭[18]， 但也有學者認為秦嶺細鱗鮭的某些形態特征與尖吻細鱗鮭和鈍吻細鱗鮭都不符合[23]。秦嶺細鱗鮭作為瀕危保護物種， 其分類地位仍不明晰， 將影響其后續的資源保護和生物學研究。

早期細鱗鮭形態學研究多采用傳統形態學測量和解剖觀察法[2，14，16—18，24，25]， 缺乏基于整體框架結構的形態差異比較以及對數據的進一步統計分析(如主成分分析、聚類分析和單因素方差分析等)。本研究基于框架結構形態度量學方法[26]， 運用統計分析手段比較細鱗魚屬的尖吻細鱗鮭、鈍吻細鱗鮭和秦嶺細鱗鮭的形態差異， 以期澄清秦嶺細鱗鮭的分類地位爭議， 為進一步開展細鱗鮭遺傳學研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣本于2014年至2017年分別采自陜西省和黑龍江省， 共計178尾。依據樣本的地理分布位置、吻部形態特征、體色及斑點形狀等[18，23]劃分為尖吻細鱗鮭、鈍吻細鱗鮭和秦嶺細鱗鮭3個類群。其中， 尖吻細鱗鮭的平均體長為(21.75±3.87) cm， 平均體重為(188.12±99.11) g； 鈍吻細鱗鮭的平均體長為(34.43±2.68) cm， 平均體重為(550.17±131.89) g； 秦嶺細鱗鮭的平均體長為(14.75±3.19) cm， 平均體重為(45.13±29.29) g。樣本詳細信息見表 1。

1.2 數據測量

形態學數據包括可量性狀和可數性狀?？闪啃誀畛?1項傳統形態學指標(如體長、體高等)外，參照框架方法[26]選取10個同源坐標點， 構成24項框架參數(圖 1和表 2)， 共35項原始形態測量值， 精確至0.01 cm。經直接計數法統計5項可數性狀， 包括第一鰓弓外鰓耙數、幽門盲囊數、側線上鱗數、側線鱗行數和側線下鱗數。

1.3 形態度量性狀測量值的標準化

魚體異速生長， 即魚體自身規格大小的異質性可能會導致形狀異質性， 從而掩蓋樣本間身體比例差異信息， 對形態測量分析結果產生一定的影響[27]。由于秦嶺細鱗鮭類群存在個體小型化趨勢[7，28]， 體長小于黑龍江流域內的同齡細鱗鮭[19，29]。為有效地描述并辨識各類群的形態差異， 對35項可量性狀的原始值進行對數轉換， 以消除樣本間異速生長及采樣時間跨度大對分析結果可能造成的影響[30]。文后提到的34項比例性狀均指經過對數轉換后的比值。數據標準化公式如下:

式中，M是原始測量值按對數轉換后的比例值；Mo是原始測量值；Lo是標準體長。

1.4 數據處理

運用Excel和SPSS 18.0軟件對5項可數性狀及34項比例性狀進行統計分析。方差分析: 對所得數據進行方差齊性檢驗和單因素方差分析(One-way ANOVA)， 對具有方差齊性的變量進行Duncan’s多重比較， 對不具方差齊性的變量采用Tamhane’s T2法分析(顯著性水平P=0.05)。主成分分析: 使用KMO和Bartlett檢驗34項比例性狀是否適合于因子分析[31]， 并提取特征值和累計貢獻率， 選取累計貢獻率大于85%的前3個主成分， 繪制主成分1、2散點圖。判別分析: 34項比例性狀用逐步判別法建立分類判別函數， 據此對各類群進行預測分類， 建立典型判別函數得分圖， 計算判別準確率和綜合判別率， 公式如下:

其中:Ai表示第i個類群判別正確的尾數，Bi表示第i個類群的實際尾數，n表示類群數。

聚類分析: 使用34項比例性狀的平均值基于歐氏距離矩陣法構建聚類樹。差異系數檢驗: 參照Mayr等[32]識別和劃分亞種的75%規則， 計算5項可數性狀和34項比例性狀的差異系數(CD值)，CD=|M1–M2|/(S1+S2)計算。式中M1、M2和S1、S2分別表示2個類群的平均值與標準差。

表 1 三個細鱗鮭類群的樣本信息Tab. 1 Sample information of three Brachymystax groups

2 結果

2.1 方差分析

單因素方差分析的結果表明34項比例性狀中有32項性狀在3個細鱗鮭類群間差異顯著(P＜0.01)，僅C5(眼徑)/C1(體長)和C16(吻端至臀鰭起點的距離)/C1(體長)分別在尖吻細鱗鮭和秦嶺細鱗鮭類群間、尖吻細鱗鮭和鈍吻細鱗鮭類群間差異不顯著(P＞0.05)； 5項可數性狀的平均水平在3個類群間均存在顯著性差異(P＜0.01， 表 3和表 4)。

圖 1 細鱗鮭的框架坐標圖Fig. 1 Truss figure of Brachymystax

2.2 主成分分析

因子分析適合度檢驗: KMO越接近于1， Bartlett的球形度檢驗顯著性水平越好(P＜0.05)， 形態度量性狀越適合作因子分析[31]。檢驗結果顯示: 34項比例性狀在類群間存在極顯著差異(P＜0.001)， KMO度量值為 0. 954， 所選變量均適合于因子分析。

主成分分析結果顯示， 前 3個主成分的累計貢獻率高達92.779%， 即前3個主成分能夠解釋3個類群間形態差異的92.779%。第1主成分的貢獻率為87.581%， 其余2項的貢獻率分別為2.698%和2.500%。表 5可知， 所有的形態學性狀與第1主成分呈正相關， 各項變量的負荷值較高。根據第1、2主成分繪制散點圖(圖 2)， 在主成分1、2水平上尖吻細鱗鮭、鈍吻細鱗鮭和秦嶺細鱗鮭類群間僅個別樣本重疊分布。

2.3 建立判別函數

利用逐步篩選法對3個細鱗鮭類群的34項比例性狀進行判別分析， 建立典型判別分析函數得分圖(圖 3)， 函數1和函數2的貢獻率分別為98.3%和1.7%， 涵蓋了類群間所有的形態差異。圖 3可看出，尖吻細鱗鮭、鈍吻細鱗鮭和秦嶺細鱗鮭各自成一個群組， 三者能夠明顯區分， 沒有重疊。

從34項比例性狀中篩選出14項有顯著貢獻的比例性狀， 并用這14項比例性狀建立3個細鱗鮭類群的分類判別函數如下:

表 2 35項形態度量性狀Tab. 2 Thirty-five morphological characters of the specimens

表 3 三個細鱗鮭類群間34項比例性狀的形態差異Tab. 3 The morphological differences of thirty-four proportional characters among three Brachymystax groups

Y1—Y3分別為尖吻細鱗鮭類群、鈍吻細鱗鮭類群和秦嶺細鱗鮭類群的判別公式；X1—X14分別為比例性狀C5/C1、C7/C1、C9/C1、C12/C1、C17/C1、C19/C1、C21/C1、C22/C1、C24/C1、C25/C1、C28/C1、C29/C1、C32/C1、C34/C1(描述見表 2)。

為驗證上述判別函數公式的實用性， 對所有測量樣本進行預測分類(表 6)， 經交互驗證， 178尾細鱗鮭僅1尾誤判， 綜合判別率為99.4%。F檢驗表明:判別效果較好，P＜0.01。

2.4 聚類分析

利用歐氏距離矩陣分析法對34項比例性狀的平均值進行系統聚類分析， 由圖 4可見， 3個類群被聚為2個不同的支， 第一支包括尖吻細鱗鮭和秦嶺細鱗鮭， 提示這兩者的形態距離較近； 而鈍吻細鱗鮭單獨成一支， 且同第一支距離較遠。

2.5 差異系數檢驗

差異系數(CD)檢驗的是某一形態特征或某幾個形態特征在群體間的差異程度， 一般用于亞種的識別， 而地理隔離是劃分亞種的首要條件[33]。由于尖吻細鱗鮭和鈍吻細鱗鮭類群間不存在地理隔離，因而只計算秦嶺細鱗鮭與尖吻細鱗鮭、鈍吻細鱗鮭類群間的差異系數。根據Mayr等[32]提出的差異系數計算公式， 秦嶺細鱗鮭和尖吻細鱗鮭之間的第一鰓弓外鰓耙數的CD值大于1.28(CD=2.01)； 而秦嶺細鱗鮭和鈍吻細鱗鮭類群間有31項比例性狀和2項可數性狀的CD值大于1.28(表 7)。

2.6 尖吻細鱗鮭、鈍吻細鱗鮭和秦嶺細鱗鮭類群檢索表

1(2) 近似橢圓形黑色斑點， 斑緣為淡白色環紋狀………………………………………秦嶺細鱗鮭

2(1) 不規則黑色斑點， 斑緣無淡白色環紋狀

3(4) 口亞下位， 上頜骨后緣不達眼中央下方；體側有紅色斑塊………………………尖吻細鱗鮭

4(3) 口端位， 上頜骨后緣伸達眼中央下方； 體側無紅色斑塊…………………………鈍吻細鱗鮭

表 4 三個細鱗鮭類群可數性狀數據及單因素方差分析結果Tab. 4 The results of one-way ANOVA and ranges of meristic characters from three Brachymystax groups

表 5 細鱗鮭34項比例性狀主成分分析的因子負荷值Tab. 5 Factor loadings of principal components extracted from thirty-four proportional characters for the three Brachymystax groups

3 討論

3.1 三個細鱗鮭類群形態差異

魚類形態變異是其對特定棲息環境條件最直觀地適應性變化。魚體形態特征受遺傳與環境因素雙重影響， 是種類鑒別和分類的重要依據[34]。在魚類形態學分析方法中， 多元統計分析方法是應用很廣泛的分析手段[35—40]， 通過研究魚類群體間形態特征上的異同程度， 有助于了解魚類群體間的親緣關系與分類系統， 進而探討魚類的起源、進化過程和趨向。

圖 2 主成分1、2散點圖Fig. 2 Scatter plots between PC1 and PC2

圖 3 典型判別式函數1、2散點圖Fig. 3 Scatter plots between DF1 and DF2

表 6 三個細鱗鮭類群的判別結果Tab. 6 Discrimination among three groups of Brachymystax

圖 4 三個細鱗鮭類群的聚類分析圖Fig. 4 Dendrogram showing the relationship of three Brachymystax groups

本研究的方差分析結果表明尖吻細鱗鮭、鈍吻細鱗鮭和秦嶺細鱗鮭在32項比例性狀和5項可數性狀上存在極顯著差異(P＜0.01)， 說明3個細鱗鮭類群的外部形態差異十分明顯。主成分分析散點圖顯示， 尖吻細鱗鮭、鈍吻細鱗鮭和秦嶺細鱗鮭三者在主成分1(貢獻率91.909%)軸上差異明顯， 基本無重疊交錯， 不同類群樣本間能夠形成相對集中的組，說明3個類群存在一定程度的分化； 所有的形態學性狀與主成分1呈正相關， 表明在類群形態學分析中存在尺寸效應(Size effect)， 類群間差異體現在魚體的整體結構上， 與扁鲹(Pomatomus saltatrix)[41]的研究結果相似。由判別分析結果可知， 3個細鱗鮭類群的判別準確率為99.4%， 能夠精確地判別細鱗鮭的類群歸屬； 典型判別函數得分圖呈現了明顯分類趨勢。高判別率提示: (1) 3個細鱗鮭類群的形態差異顯著； (2)這種判別程度可能達到亞種間或種間判別。聚類樹形圖顯示尖吻細鱗鮭和秦嶺細鱗鮭聚為一支， 而鈍吻細鱗鮭單獨呈一個分支， 尖吻細鱗鮭和秦嶺細鱗鮭分類地位較近， 親緣關系也相對較近。

根據Mayr等[32]提出的75%亞種識別和鑒定的標準， 如果同一物種的2個異域分布的種群之間存在形態特征差異， 即A群體75%的個體和B群體97%的個體能分開， 那么這2個群體之間的形態特征差異系數值應為1.28， 則2個群體應分屬于不同的亞種， 即1.28是亞種分化的閾值。若差異系數(CD)值大于1.28則認為它們之間的差異達亞種水平； 反之， 小于1.28則認為差異屬于不同地理種群的差異。然而， Mayr等[32]也強調指出使用差異系數這一指標區分亞種時應慎重: 該方法并沒有完全考慮到在亞種確認上的其他生物學和生物地理學的因素； 要確認亞種地位還必須借助其他資料予以準確估量。本研究中尖吻細鱗鮭和秦嶺細鱗鮭類群僅第一鰓弓外鰓耙數的差異達亞種分化水平。在魚類分類中， 僅僅以形態特征的CD值1.28作為亞種劃分依據， 研究者須持謹慎態度[42，43]。例如， 基于54項形態特征分析胡鯰屬(Clarias)4個物種間的差異系數值， 結果顯示鰻胡鯰(C. anguillaris) 和尖齒胡鯰(C. gariepinus) 2個物種間的CD值小于1.28； 白斑胡鯰(C. albopunctatus)和伊布里胡鯰(C. ebriensis)物種間的CD值也小于1.28[44]。徐敬明等[45]發現厚蟹屬原分類為2個物種的天津厚蟹和側足厚蟹之間的形態差異較小， 它們的差異系數值均小于亞種識別的閾值1.28， 因而將它們作為同一物種的2個亞種處理。

細鱗鮭屬類群間形態學測量值的方差分析、主成分分析、判別分析和CD值等的結果顯示， 秦嶺細鱗鮭在形態特征上與黑龍江流域的尖吻細鱗鮭、鈍吻細鱗鮭存在明顯差異。

表 7 不同類群比例性狀和可數性狀的差異系數值Tab. 7 The coefficient of difference of the proportional and meristic characters among different Brachymystax groups

3.2 細鱗鮭屬魚類分類地位探討

細鱗鮭屬起源于亞歐北寒帶， 主要分布于北寒帶及北溫帶北部， 少數分布于暖溫帶高海拔地區，在第四紀冰期南遷至我國， 而分布在秦嶺地區的細鱗鮭被認為是冰川期的殘留種[46]。Froufe等[47]研究了分布在西伯利亞地區的尖吻細鱗鮭和鈍吻細鱗鮭的進化史， 確定這2種細鱗鮭應被作為2個獨立的物種， 隨后這一觀點被我國學者在黑龍江流域的2種不同吻部特征的細鱗鮭上得到證實[18—22]。

相比其他脊椎動物而言， 魚類形態特征在種群內部和種群之間的變異更大， 且更易受環境的影響[48]。細鱗鮭屬魚類群體間形態差異和地理隔離有直接關系， 大約在216萬年前黃河流域和黑龍江流域的細鱗鮭就已形成地理隔離， 且細鱗鮭的點狀不連續分布與青藏高原隆起導致亞洲內陸干旱化有關[49]。李思忠于1966年對比了采自秦嶺太白山東側和南側的40余尾細鱗鮭和黑龍江湯原縣的2尾標本后，以幽門盲囊、側線鱗、鰓耙數等形態學指標變化差異以及體長大小等為主要區別特征， 認定秦嶺細鱗鮭為新的亞種， 并定名為秦嶺細鱗鮭Brachymystax lenok tsinlingensisLi， 同文指出黑龍江和新疆等地的細鱗鮭為指名亞種B. lenok lenok(Pallas)[14]。隨后一些學者比對陜西渭河、漢水、甘肅黃河水系與黑龍江、圖們江、鴨綠江及松花江等地的多尾細鱗鮭標本， 發現除體長比北方個體稍小外， 其他性狀的變異仍在同一區間范圍， 因而對秦嶺細鱗鮭的亞種地位提出質疑， 他們認為秦嶺細鱗鮭與細鱗鮭(指名亞種)群體之間形態特征部分重疊， 生化同工酶電泳譜帶一致， 不能把秦嶺細鱗鮭劃分為新亞種[2，16，17]。馬波等[18]對黑龍江流域兩種細鱗鮭(尖吻細鱗鮭和鈍吻細鱗鮭)進行形態學比較， 并依據文獻資料推測秦嶺細鱗鮭的主要形態學性狀與鈍吻細鱗鮭較相似。早期文獻采用傳統形態學測量和解剖法認定秦嶺細鱗鮭為新亞種， 而其分類地位至今仍不明晰的原因主要是傳統的形態測量方法上存在一定的缺陷， 僅采用水平和垂直方向的測量距離， 多局限于測量頭部和尾部特征， 未能覆蓋整個魚體表面， 無法全面地描述魚體外部形態特征，容易造成細鱗鮭屬魚類形態特征差異及物種有效性鑒別偏差。而本文選用多變量形態度量學方法結合多元統計分析， 通過篩選存有顯著性差異的形態特征來反映魚體形態差異， 能更有效地辨別的尖吻細鱗鮭、鈍吻細鱗鮭和秦嶺細鱗鮭之間的形態差異。

分子生物學角度， 杜巖巖等[15]基于線粒體控制區(D-Loop)部分序列的測定結果， 發現秦嶺細鱗鮭在進化分支上呈單系支且3個細鱗鮭類群間的遺傳距離大于類群內遺傳距離， 該結果支持秦嶺細鱗鮭的亞種分類地位。通過對Cytb基因的分子系統研究， Xing等[25]發現秦嶺細鱗鮭與尖吻細鱗鮭、鈍吻細鱗鮭的遺傳距離(0.020—0.022和0.034)大于哲羅鮭屬3個物種兩兩間的遺傳距離(0.008—0.016)； 且秦嶺細鱗鮭類群在系統發育樹上呈一個有獨立進化史的單系群， 與尖吻細鱗鮭構成一個分支， 而鈍吻細鱗鮭單獨成一支， 該文認為秦嶺細鱗鮭是一個有效的獨立物種， 重命名為B. tsinlingensisLi，1966。結合已有的分子生物學證據， 本研究的多元統計分析結果提示， 秦嶺細鱗鮭和尖吻細鱗鮭類群間的形態差異顯著， 而與鈍吻細鱗鮭類群的差異更大； 同時， 本文基于形態學數據構建的聚類分析圖顯示秦嶺細鱗鮭與尖吻細鱗鮭聚為一支， 與Xing等[25]基于線粒體DNA數據的分子進化樹結果一致， 而與之前的秦嶺細鱗鮭與鈍吻細鱗鮭更相近的觀點不一致[18]。

本研究的結果支持秦嶺細鱗鮭與黑龍江流域內的尖吻細鱗鮭的分化程度至少已達亞種水平， 但秦嶺細鱗鮭是否應該被看作一個獨立物種， 有待商榷以及進一步研究來證實。此外， 要揭示秦嶺細鱗鮭與尖吻細鱗鮭、鈍吻細鱗鮭的關系， 尚需結合分子遺傳標記做更深入的研究。

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