褐菖鲉的聽覺閾值研究

張旭光 郭弘藝 宋佳坤

(1. 上海海洋大學海洋動物系統分類與進化上海高校重點實驗室， 上海 201306； 2. 上海海大學科技部海洋生物學國際聯合研究中心， 上海 201306； 3. 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心， 上海 201306)

水下噪聲污染是近年來備受關注的環境污染問題， 尤其是來自航運中船舶馬達和海上風電機的低頻噪聲污染日益嚴重[1]。魚類可以通過內耳來感知水中的聲音信號， 此外， 聲信號在其捕食、避害、生殖、洄游、棲息地選擇等行為中都有重要的作用[2]。而水下噪聲不僅會遮蔽與魚類上述行為相關的聲音線索， 甚至會造成魚類的聽覺喪失和內分泌應激反應等負面影響[3，4]， 從而影響其攝食、避害、生殖和洄游等行為， 長期以往可能會影響其種群補充量、群體結構和生態功能等。

褐菖鲉(Sebasticus marmoratus)是典型的近岸巖礁魚類， 廣泛分布于我國東南沿海， 具有較高的生態意義和經濟價值[5]。由于航道開發和近岸工程等人為活動的影響， 褐菖鲉的活動范圍受到了嚴重地縮減， 其野生資源量已急劇下降， 急需對褐菖鲉資源開展保護[6]。最近的研究表明， 褐菖鲉可通過魚鰾肌收縮發出聲音進行種間聲訊交流[7，8]。這樣，近岸水下工程產生的水下噪聲以及船舶噪聲則可能對其聲訊交流造成一定的影響。確定褐菖鲉的聽覺敏感性是評估水下噪聲對其影響的重要前提。Lee等[9]曾利用行為馴化條件下的心電圖技術研究了褐菖鲉的聽覺閾值。然而， 這種方法需要實驗魚經過一段長期的訓練以形成生理上對聲音信號的條件反射， 并不能客觀反映實驗對象的聽覺特性。目前， 聽覺誘發位電位(Auditory Evoked Potential， AEP)作為一種微創傷性的電生理技術廣泛應用于魚類的聽覺方面的各種研究中[10]。因此， 本文利用聽覺誘發電位法研究褐菖鲉的聽覺閾值， 以確定其聽覺敏感性， 進一步理解其聲訊交流機制和環境適應性機制， 并為水下噪聲對經濟魚類的影響評估提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用褐菖鲉為浙江省舟山枸杞島(30°42′48″N，122°46′42″E)附近海域采用定置網具所捕的漁獲物，全長7.3—13.2 cm， 平均(10.3±2.1) cm， 體重30—60 g， 平均(45.3±12) g。實驗魚由船運至實驗室暫養， 暫養水槽規格為100 cm×40 cm×45 cm， 水溫為22—24℃， 正常自然光照。根據褐菖鲉喜棲巖礁的特性， 暫養水槽內放置多個瓦礫塊作為其棲息場所。暫養期間投喂人工配合顆粒飼料以及小雜魚。實驗前， 挑選無外傷， 有活力的褐菖鲉進行實驗。實驗前采用0.1%的MS-222麻醉3—5min， 并在其軀干背部注射加拉碘銨抑制肌肉活動， 劑量為2—4 μg/g(體重)， 僅見魚鰓蓋輕微扇動。

1.2 AEP記錄

實驗魚通過自制的夾持器固定在實驗水槽中(r=15 cm)， 并通過自重力富氧流水進行人工灌流，以保持實驗魚的呼吸[11，12]。水槽放置于位于隔音室(2.5 m×2.5 m×2 m， 上海聲諾)內的防震臺(ZDT07-07， 江西連勝)上。隔音室內的空氣本底噪聲為25 dB(上海聲諾)。

實驗時， 使魚頭部背側露出水面1—2 mm， 記錄電極(Rochester Electro-Medical， 美國)置于頭骨的中縫線上， 延腦上方。參考電極置于記錄電極前方1—2 cm處。2個電極穿過紙巾緊緊地固定于皮膚上。另有一根接地電極置于魚尾附近的水體中。所有電極均直接連接至前置放大器(RA4LI，Tucker Davis Technologies TDT， 美國)， 并通過光纖與TDT聽覺生理工作站(RZ6， 內置數模轉換和信號同步， TDT， 美國)相連。

聲音刺激文件由軟件SigGenRZ (TDT， 美國)設置。頻率設置為100、150、200、300、500、800、1000 Hz。聲音時程(Duration)為12ms， 含2ms起落(rase/fall)， 以減少聲音輸出的瞬變。聲音信號通過功率放大器(D75A， Crown， 英國)輸至位于水槽底部的水下揚聲器(UW-30， University Sound， 美國)。實驗魚距離水下揚聲器 18 cm， 水槽內的實際聲音信號， 由置于魚耳附近的水聽器(8103， B&K， 丹麥)進行實時測量。測量的聲音信號通過電荷放大器(2692， B&K， 丹麥)輸入TDT數模轉換模塊。實驗中采集的AEP信號經放大器， 也輸入TDT數模轉換模塊， 并由軟件BigSigRZ (TDT， 美國)同步保存聲音信號與AEP信號。

實驗魚聽覺閾值確定方法與Kenyon等相似[11，13]。實驗時設置2個相位相反的刺激聲音， 分別為90°和270°， 如果它們誘發的腦電位波形具有重合性， 即可視為正確的AEP反應。聲音刺激強度設置為從110到60 dB， 每次以3 dB遞減， 直至不可產生可重復的AEP波形， 此時對應的刺激聲音的聲壓級即為該頻率的聽覺閾值[14，15]。實際刺激聲的聲壓級通過水聽器記錄的聲音波形和水聽器校正系數共同確定。

2 結果

2.1 褐菖鲉AEP波形特征

實驗對8條褐菖鲉進行了AEP測試。2個相位相反的刺激聲音誘發的AEP波形可以基本重合(圖1)， 而且2個AEP波形之間的自相關系數(R值)也較高。但隨著刺激強度的降低， AEP波形的自相關系數(R值)也逐漸降低。在刺激強度較大時， 其R值在0.7—0.9內波動， 當接近聽覺閾值時， 其R值急劇下降， 但波形仍表現一定的反應幅度。AEP反應的波形幅度也隨著刺激強度的降低而減弱， 通常反應幅度降至10—20 μV左右時， 基本也接近聽覺閾值。由于AEP反應具有與聲音相位無關的特性[10，16]， 如果AEP波形不能重合時， 即無AEP反應， 其R值則可能接近或低于零。

根據波形形狀特點， 褐菖鲉AEP波形可分為3類(圖 2)。一類是100 Hz低頻信號誘發的AEP波形， 波形相對于基線波動較平緩； 第二類是150—300 Hz誘發的AEP波形， 首先是產生1個相對于基線的負向峰， 在這個負向峰上可能出現多個小的負向峰， 緊接著1個相對基線的正向峰； 第三類是500—800 Hz誘發的AEP波形首先是一個相對于基線的正向起伏， 緊接著一個緩慢的負向峰。

褐菖鲉AEP波形的另一個基本特征是AEP反應頻率幾乎是刺激頻率的兩倍。如圖 3所示， 150 Hz的聲音信號在水槽中的實際頻率為143 Hz， 其對應的AEP波形的頻譜中則存在具有二倍關系的287 Hz頻率峰， 而另一個597 Hz的頻率峰則可能來自聲音信號中262 Hz的聲音畸變信號。這種兩倍關系的特點也可簡單的從兩者波形疏密程度看出(圖 2)。

2.2 褐菖鲉聽力圖

實驗共記錄了8尾褐菖鲉對100—1000 Hz短純音刺激的AEP反應。將8尾褐菖鲉在各測量頻率下獲得的聽覺閾值平均后， 可得出褐菖鲉的聽力曲線圖(圖 4， AEP)。根據聽力曲線圖， 褐菖鲉的聽力曲線在100—1000 Hz的頻率范圍內呈線性上升， 聽覺閾值隨聲音頻率的增加而增加， 即隨著聲音頻率的增加， 褐菖鲉聽覺敏感性降低。褐菖鲉對低頻聲音信號較敏感， 主要頻率范圍100—300 Hz， 其聽覺閾值為70—79 dB， 其中最敏感的頻率為150 Hz， 對應的聽覺閾值為(70±1.1) dB， 對500 Hz以上的聲音敏感性較差， 其聽覺閾值已達90 dB以上。

3 討論

圖 1 不同相位和刺激強度誘發的褐菖鲉AEP波形Fig. 1 AEP wave forms of marbled rockfish in response to 100 Hz tone bursts at stimulus levels from 86.9 dB to 54 dB with starting phases of 90° and 270°， respectively

目前， 聽覺誘發電位法(AEP)是世界公認的最快、最準確的確定魚類聽覺閾值的方法[14]。相對傳統的行為條件反射方法或其它創傷性電生理法，AEP方法無需對動物長期馴化或進行組織破壞性的解剖， 具有快速、可重復試驗的優點[13—17]。本文首次應用聽覺腦干誘發電位法研究了鲉形目魚類褐菖鲉的聽覺閾值。確定動物的電位變化是否為AEP反應的方法是采用相位相反的二組聲音刺激，如果誘發波形表現出與刺激聲音相位無關的波形重合性， 則表明該電位變化為正確的AEP波形。波形重合性可以通過第二實驗人經肉眼檢測或通過波形自相關系數進行檢測。理論上來說， 相位相反的聲音信號互相疊加后可消除AEP波形中聲音信號的干擾[16]。然而， 由于實驗條件限制， 如實驗水槽的諧振， 聲音的反射等， 聲音信號疊加后并不能完全消除， 依然存在一些聲音信號的殘跡， 但聲音偽跡的特點是波形起伏相對于基線是平行的。而AEP波形在疊加后， 表現出相對于基線起伏的正向或負向峰(圖 2)， 這與Kenyon等[13]在金魚(Carassius auratus)聽覺閾值研究中的結果相似。但是， 褐菖鲉在低頻段的AEP波形相對基線起伏較平緩， 只有在高頻段的AEP波形才有相對基線的負向或正向起伏。Lu等[17]在金魚的聽覺閾值研究中發現， 100 Hz的純音誘發的AEP波形也相對基線較平緩， 只有500 Hz時， 才出現相對于基線起伏顯著的波峰。在魚類中， 一般只有高頻短純音可以誘發較好的聽覺腦干電位， 這可能與聽覺神經元的頻率響應有關，但具體的神經機制還尚不清楚[18]。另外， 魚類對聲音或機械波的感受主要涉及聲壓感受或微粒子運動位移感受。對于聽覺敏感型魚類， 通過魚鰾與內耳的連接(或相對靠近)提高了聲壓感受的敏感性，也提高的聽覺閾值的上限[19]。因此， 聽覺敏感型的魚類的聽覺上限可達數千赫茲。缺乏內耳與魚鰾聯系的魚類則對低頻的微粒子運動位移更敏感， 而無鰾魚類則只對微粒子位移敏感[20，21]?？梢?， 聽覺腦干誘發電位更適用于聲壓感受魚類的聽覺閾值研究， 而低頻聲音信號除聲壓信號外還涉及更多的粒子位移信號[21]。因此， 低頻聲音信號誘發的聽覺腦干電位波形表現出非典型的AEP特征。AEP反應的另一特征是其反應頻率接近刺激頻率的二倍，這與聽覺毛細胞成對排列有關[22]。然而， 在金魚的聽覺研究中也發現， 當聲音刺激高于2000 Hz時， 這一規律并不是很顯著， 其AEP的反應頻率則小于刺激頻率的二倍值[17]， 其中的機制尚待進一步研究。

圖 2 不同頻率刺激聲音的誘發的褐菖鲉AEP波形Fig. 2 AEP wave forms of marbled rockfish in response to tone bursts with different frequencies

目前， 對鲉科魚類聽覺閾值的研究較少。Lee等[9]通過行為馴化條件反射的心電記錄對褐菖鲉的聽覺閾值進行了研究， 其行為聽力曲線與聽覺誘發電位法所得到的褐菖鲉聽力曲線基本相似。行為學檢測結果表明， 褐菖鲉其敏感的頻率范圍為80—300 Hz， 其中對100 Hz聲音最為敏感， 對應的聽覺閾值為90 dB。對300 Hz以上聲音敏感性較差，閾值已達120 dB以上(圖 4， ECG)。而AEP實驗中，褐菖鲉的敏感頻率范圍為100—300 Hz， 其中150 Hz為最敏感頻率， 對應閾值為70 dB， 比行為聽覺閾值低20 dB。Kojima等[23]利用行為學和AEP方法對真鯛(Pagrus major)的聽覺閾值進行了對比研究， 結果表明， 兩種方法得到的聽力曲線形狀相同， 但行為學聽覺閾值卻比AEP聽覺閾值高15 dB左右。同樣，對聽覺普通型魚類眼斑星麗魚(Astronotus ocellatus)的比較研究表明， 行為聽覺閾值比AEP聽覺閾值要高10 dB以上[13]。雖然， 不同實驗室在不同條件下所得的聽覺閾值存在差異， 但是不同方法所體現的頻率敏感性卻基本相近。根據行為學和AEP實驗結果(圖 4)， 可知褐菖鲉對低頻聲音信號敏感， 對500 Hz以上的聲音敏感性較差。

褐菖鲉可通過魚鰾肌收縮發出主頻為(172±2.5) Hz左右的低頻信號， 用于種間的聲訊交流[7，24]。AEP實驗表明褐菖鲉聽覺敏感性在100—300 Hz，這種發聲頻率與聽覺敏感性的高度匹配性， 表明了其感覺系統協同進化的適應性[25]。然而， 由于海洋航運和水下工程使海洋中的低頻噪聲污染日益嚴重， 如海上風電場運營期的水下噪聲主要頻率為125 Hz[26]， 而船舶馬達聲的水下噪聲也以低頻為主，聲壓級可高達150 dB以上[27，28]。這樣， 水下噪聲污染則可能對褐菖鲉的聲訊交流造成影響。因此， 亟需開展海洋中近岸人為噪聲對褐菖鲉個體或群體行為影響的相關研究， 以保護褐菖鲉的野生資源進而實現對該資源的持續利用。

圖 3 150 Hz刺激聲音(A)和褐菖鲉AEP波形(B)的頻譜Fig. 3 The FFT of (A) 150 Hz sound stimulus and (B) AEP wave form of marbled rockfish

圖 4 褐菖鲉聽力曲線比較Fig. 4 Audiograms of the S. marmoratus from methods AEP and electrocardiogram (ECG)， respectively[9]

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