集胞藻PCC 6803高產精氨酸藻株的紫外誘變選育

戢水玲 高 宏

(1. 中國科學院水生生物研究所， 中國科學院藻類生物學重點實驗室， 武漢 430072； 2. 中國科學院大學， 北京 100049)

精氨酸是尿素循環的重要中間代謝物， 在醫藥和食品工業上具有廣泛用途:它是復方氨基酸輸液的主要成分之一， 是氨中毒性肝昏迷的解毒劑和肝功能的促進劑， 對病毒性肝炎療效顯著， 它還經常用作飼料、食品等的添加劑。

紫外(Ultraviolet， UV)誘變育種， 是利用波長為254 nm的紫外線能引起DNA結構發生改變形成嘧啶二聚體， 尤其是胸腺嘧啶二聚體這一特點， 引起微生物遺傳性狀發生改變， 然后通過抗性藥物篩選出少數性狀優良的突變株的過程[1]。之前報道用來精氨酸誘變育種的菌株主要有谷氨酸棒狀桿菌、鈍齒棒狀桿菌、枯草芽孢桿菌和黃色短桿菌， 所使用的抗性標記物主要有D-精氨酸、L-刀豆氨酸、6-氮尿嘧啶、磺胺胍和精氨酸氧肟酸等[2]。然而這些菌株利用的氮源主要為有機氮源， 如: 牛肉膏、蛋白胨、酵母粗提物等。

集胞藻PCC 6803是單細胞藍藻， 能進行光合自養生長， 也能利用葡萄糖進行混養、異養生長[3]， 可利用硝酸鹽和亞硝酸鹽作為氮源， 合成自己所需的氨基酸等化合物[4]。在工業生產所釋放的煙氣中，氮氧化物(NOx)是造成酸雨、霧霾的元兇[5]。然而NOx可與水反應形成硝酸根和亞硝酸根， 被藍藻利用。因此可以在集胞藻PCC 6803中選育高產精氨酸同時去除NOx的藻株。

在精氨酸誘變育種的抗性標記物中， D-精氨酸、L-刀豆氨酸和精氨酸氧肟酸都是L-精氨酸的類似物， 而6-氮尿嘧啶是嘧啶堿基的類似物。在細胞內L-精氨酸對自身合成途徑中的關鍵酶N-乙酰谷氨酸激酶有著反饋抑制作用[6]， 通過篩選抗L-精氨酸類似物的突變株， 可以獲得L-精氨酸反饋抑制減弱的突變株， 從而使細胞能大量積累精氨酸。氨甲酰磷酸是合成精氨酸和嘧啶的前體物， 受精氨酸和嘧啶堿基的積累阻遏， 當二者存其一時， 發生部分阻遏； 當二者共存時， 幾乎發生完全阻遏， 因此選育6-氮尿嘧啶抗性有利于氨甲酰磷酸的積累， 從而有利于精氨酸的合成[7]?；诖?， 本研究選擇D-精氨酸和6-氮尿嘧啶作為紫外誘變的抗性標記物， 試圖在集胞藻PCC 6803中選育將硝酸鹽轉化為精氨酸的藻株， 將來可用于去除工業廢氣中的NOx。

1 材料與方法

1.1 藻株和培養條件

集胞藻PCC 6803野生型(wild type， wt)是由北京大學趙進東教授贈送， 集胞藻#13807是分泌精氨酸突變株。除初篩和復篩時培養基中NaNO3濃度為12 g/L外， 藻株的培養條件均為30℃、30 μE/(m2.s)持續光照下BG11培養基混養(1 g/L葡萄糖)培養。

1.2 藻株的紫外誘變

藻株紫外誘變的方法參考Meireles和Tillich的報道[8，9]。具體方法為: 用254 nm波長的紫外光輻射對數期(A730=0.8)的細胞， 輻射一定時間后立即關掉紫外燈。接著在紅光(632 nm， 避免光修復[10])下用沒有任何抗性的BG11洗滌藻細胞一次， 1.5 mL培養基重懸后， 涂布在鋪了NC膜的沒有任何抗性的平板上。將所有平板用錫箔紙包住后在黑暗下放置1d后轉移NC膜到添加了相應抗性標記物的平板上， 30℃、30 μE/(m2.s)持續光照培養7—10d， 長出單藻落后劃線， 用來后續實驗。

選擇最佳誘變時間的方法是: 每個輻射時間點取500 μL藻細胞稀釋10–4后取200 μL涂布平板， 將所有平板用錫箔紙包住后在黑暗下放置1d， 之后在30℃、30 μE/(m2.s)持續光照下培養7—10d， 待長出單藻落后統計藻落數目， 計算致死率。假設某個輻射時間點的藻落數為n， 未經輻射的藻落數為m， 則:致死率=(m–n)/m×100%。取致死率約為85%對應的輻射時間為最佳誘變時間。

選擇抗性標記物臨界濃度的方法是: 取對數期的藻細胞在含有不同濃度梯度的抗性標記物培養基中培養， 每個濃度梯度設4個平行， 初始接種A730≈0.05， 培養4d后測OD730。以添加抗性標記物作為實驗組， 以不加作為對照組， 計算存活率。存活率=實驗組A730/對照組A730×100%。取存活率約為3%對應的濃度為抗性標記物臨界濃度。

1.3 藻株游離氨基酸的提取

胞外游離氨基酸的提取方法為: 藻細胞經4500×g離心后收集上清液并經0.45 μm過濾器過濾后收集濾液部分用作細胞外游離氨基酸的分析。胞內游離氨基酸的提取參考文獻[11]略有改動: 將離心后的藻細胞先用無菌水洗滌2次， 然后用80%的乙醇重懸， 于65℃水浴抽提3h后離心取上清， 經0.45 μm過濾器過濾后濾液部分用作胞內游離氨基酸分析。

1.4 比色法檢測精氨酸濃度

初篩采用比色法檢測精氨酸濃度[12]， 其方法是: 在Eppendorf管中依次加入40 g/L NaOH溶液、80 g/L甲萘酚正丙醇溶液和0.5 mL/L雙乙酰正丙醇溶液各300 μL， 再加入300 μL的待測樣品。震蕩搖勻后， 在30℃水浴15min后檢測OD540值， 根據標準曲線換算成精氨酸濃度， 計算每OD730值細胞總精氨酸產量， 據此來評價藻株的產酸能力。每OD730值細胞總精氨酸產量=(胞內精氨酸濃度+胞外精氨酸濃度)/A730。

1.5 高效液相色譜(HPLC)分析精氨酸濃度

復篩采用HPLC檢測精氨酸濃度， 其方法參考文獻[13， 14]， 具體方法如下:

高效液相色譜儀是島津LC-20A型， 由兩臺LC-20A高壓泵， RF-10AXL熒光檢測器， CAPLUGS RC-11型注射進樣閥， CTO-20A柱恒溫箱， CBM-20A系統控制器組成。色譜柱為安捷倫Zorbax Eclipse-AAA色譜柱(Agilent， USA)， 150 mm×4.6 mm， 粒徑3.5 μm。流動相A: 40 mmol/L Na2HPO4pH 7.8； 流動相B∶乙腈∶甲醇∶H2O (45∶45∶10v∶v∶v)。

色譜儀工作程序設置的總流量為2 mL/min， 運行時間時26min。0—1.9min， B%(流動相B流速的比例)為0； 1.9—18.1min， B%從0—57%；18.1—18.6min， B%從57%—100%； 18.6—22.3min，B%保持100%； 22.3—23.2min， B%從100%—0；23.2—26min， B%保持為0。檢測器的設置為0—16.8min， 激發光/發射光=340/450 nm； 16.8—26min， 激發光/發射光= 266/305 nm。柱溫箱設置溫度為40℃。

分析過程: 取待測樣品15 μL加入到75 μL的硼酸鹽緩沖液(pH 10.2)中， 振蕩混勻； 之后加入15 μL的鄰苯二甲醛衍生試劑(鄰苯二甲醛和3-巰基丙酸各10 mg/mL)， 振蕩混勻； 再加入15 μL的2.5 mg/mL 9-芴甲基氯甲酸酯衍生試劑， 振蕩混勻后加入960 μL的H2O充分混勻后， 經0.45 μm過濾器過濾后用注射器吸取50 μL手動進樣檢測。

1.6 野生型及其突變株的生長曲線

取對數期的細胞接種到50 mL無任何抗性的BG11培養基中， 在30℃、30 μE/(m2.s)持續光照條件下振蕩(100 r/min)混養培養， 藻細胞的初始接種濃度OD730為0.05。每個藻株作3個平行試驗， 每天定時取樣測OD730， 繪制生長曲線。

1.7 數據處理

數據采用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0進行統計分析、作圖等。

2 結果

2.1 篩選抗D-精氨酸突變株的結果

作者以集胞藻#13807為紫外誘變出發株， 檢測了不同輻射時間的致死率， 發現10—30s致死率急劇增加， 其中20—30s致死率為70%—90%， 40s以后藻細胞全部死亡。由于過高的致死率會導致藻株變異幅度大， 產生較多負突變株， 而太低的致死率又很難達到誘變效果， 因此選擇合適的誘變劑量，對獲得最佳的誘變效果極為重要。一般來說， 選擇致死率在75%—85%之間的誘變劑量較合適， 因此本研究選取25s作為集胞藻#13807的最佳誘變時間。

檢測集胞藻#13807耐受D-精氨酸的臨界濃度，如圖 1所示， 在D-精氨酸為0.6 g/L時藻細胞的存活率僅為5%， 表明此濃度的D-精氨酸已經完全抑制了藻細胞的生長。當提高D-精氨酸濃度至0.8 g/L時藻細胞的存活率僅為3%， 因此本研究選擇0.8 g/L作為集胞藻#13807耐受D-精氨酸的臨界濃度。

圖 1 集胞藻#13807在不同濃度D-精氨酸培養條件下的存活率Fig. 1 The effect of different D-arginine concentrations on the survival rate of #13807

對集胞藻#13807經紫外誘變得到的突變子先在含有0.8 g/L D-精氨酸的固體平板上劃線， 然后接種到含0.8 g/L D-精氨酸的液體培養基中培養， 經固體、液體培養基兩步抗性篩選后共得到173株用來初篩。對這173株突變株用比色法檢測每OD730值細胞總精氨酸產量后， 選取了14株總精氨酸產量提高10倍左右的藻株進行復篩， 經過HPLC分析選取了產量最高的4株做了3次平行實驗， 如圖 2所示，#13807-111是精氨酸產量顯著提高的突變株， 其每OD730值細胞總精氨酸產量相比出發株提高了2.4倍。

2.2 篩選抗6-氮尿嘧啶突變株的結果

為了進一步提高精氨酸產量， 作者對#13807-111進行了第二輪紫外誘變。首先檢測了該藻株不同輻射時間的致死率， 結果發現在輻射時間僅為10s時致死率已經達到了80%， 而到15s的時候藻細胞就全部死亡， 因此選擇10s作為第二輪的最佳誘變時間。

圖 2 集胞藻#13807及其突變株每OD730值細胞總精氨酸產量Fig. 2 Total arginine production per OD730 of #13807 and its mutants

檢測#13807-111耐受6-氮尿嘧啶的臨界濃度，如圖 3所示， 當6-氮尿嘧啶濃度為0.2 g/L時， 藻細胞存活率僅為4%， 表明此濃度的6-氮尿嘧啶已經完全抑制了藻細胞的生長， 因此本輪誘變選擇0.2 g/L作為#13807-111耐受6-氮尿嘧啶的臨界濃度。

圖 3 #13807-111在不同濃度6-氮尿嘧啶培養條件下的存活率Fig. 3 The effect of 6-azauracil on the survival rate of #13807-111

對#13807-111經紫外誘變得到的突變子先在含有0.8 g/L D-精氨酸和0.2 g/L 6-氮尿嘧啶的固體平板上劃線， 然后接種到含0.8 g/L D-精氨酸和0.2 g/L 6-氮尿嘧啶的液體培養基中培養， 經固體、液體培養基兩步抗性篩選后共得到118株用來初篩。對這118株突變株用比色法檢測每OD730值細胞總精氨酸產量后選取了14株產量提高3倍左右的藻株進行復篩， 經HPLC分析獲得了一株精氨產量有所提高的突變株#13807-111-55。

對野生型、#13807-111和#13807-111-55繪制了生長曲線， 如圖 4所示， 結果表明突變株和野生型的生長速率沒有顯著差別(P＞0.05)。

將出發藻株和兩輪誘變得到的突變株同批次培養， 保證培養條件一致: 所有的藻株都在NaNO3為12 g/L、葡萄糖1 g/L的BG11培養基中混養培養10d后HPLC檢測胞內、胞外精氨酸產量， 結果如圖5所示， 每OD730值細胞， 集胞藻#13807和它的突變株胞內精氨酸產量差異不顯著(P＞0.05)且都很低，然而它們的胞外精氨酸產量卻有顯著差別(P＜0.05):#13807-111和#13807-111-55的每OD730值細胞胞外精氨酸產量相比#13807分別提高了47.8倍和62.3倍，這表明本研究選育的抗D-精氨酸突變株#13807-111和抗D-精氨酸和6-氮尿嘧啶突變株#13807-111-55都是分泌精氨酸突變株。這兩株藻中， 對于每OD730值細胞， #13807-111的總精氨酸產量相比出發株集胞藻#13807有顯著提高(P＜0.05)， 而#13807-111-55的總精氨酸產量相比#13807-111只有略微提升(P＞0.05)， 表明篩選D-精氨酸抗性更有利于提高精氨酸產量， 而6-氮尿嘧啶抗性對提高精氨酸產量影響很小。雖然如此， 通過兩輪紫外誘變篩選抗D-精氨酸和6-氮尿嘧啶的突變株， 作者選育到了每OD730值細胞胞外精氨酸產量提高62.3倍， 總精氨酸產量提高6.0倍的藻株#13807-111-55， 該藻株是一株分泌精氨酸突變株， 每OD730值細胞的胞外和總精氨酸產量分別達到(0.76±0.1) mg/(L.OD730)和(0.82±0.08) mg/(L.OD730)。

圖 4 野生型和突變株在30℃、30 μE/(m2.s)混養條件下生長曲線Fig. 4 Growth curves of the wild-type and mutants at 30℃ and 30 μE/(m2.s) under mixotrophic growth conditions

圖 5 集胞藻#13807及其突變株每OD730值細胞精氨酸產量Fig. 5 Arginine production per OD730 of #13807 and its mutants

3 討論

#13807-111是集胞藻#13807經紫外輻射25s得到的突變株， 然而檢測該藻株不同輻射時間的致死率， 發現在輻射時間僅為10s時致死率已經達到了80%， 而到15s的時候藻細胞就全部死亡， 造成這一結果的可能原因是紫外誘變對#13807-111某些基因或者位點造成了損傷， 使得它對紫外輻射更加敏感了， 在很小劑量的紫外輻射條件下都有可能造成藻細胞死亡。這提示我們在多次紫外誘變過程中，需要對每次的出發株測試致死率， 從而確定最佳的誘變時間。

D-精氨酸是L-精氨酸的類似物， 通過篩選抗D-精氨酸的藻株可以選育到精氨酸反饋抑制減弱的突變株， 從而提高精氨酸產量。本研究第一輪誘變通過篩選抗D-精氨酸突變株選育到了精氨酸產量顯著提高的突變株#13807-111， 其每OD730值細胞總精氨酸產量相比出發株提高了6.0倍， 表明在藍藻中篩選D-精氨酸抗性能夠顯著提高精氨酸產量。此外該藻株和#13807-111-55的精氨酸主要分泌到了胞外， 表明這兩株突變株都是分泌精氨酸突變株，這可能是因為紫外誘變造成的突變不僅減弱了L-精氨酸的反饋抑制使得總精氨酸產量提高， 而且也改變了細胞膜的通透性使精氨酸分泌到胞外。

6-氮尿嘧啶是嘧啶堿基的類似物， 而嘧啶堿基阻遏氨甲酰磷酸的合成從而影響精氨酸的合成[7]，因此選育6-氮尿嘧啶抗性有利于精氨酸的合成。之前有報道稱在枯草芽孢桿菌中， Kato等[15]利用亞硝基胍誘變， 選育到了耐受0.1 g/L 6-氮尿嘧啶的突變株AAr-9， 它的精氨酸產量相比出發菌株提高了1.7倍， 達到28 g/L。在本研究中， 利用D-精氨酸抗性選育到了精氨酸產量顯著提高的藻株， 而利用6-氮尿嘧啶抗性選育卻并沒有成功。這可能是因為在枯草芽孢桿菌中， 通過選育6-氮尿嘧啶抗性來提高精氨酸產量的方法， 在藍藻中不一定適用， 需要選擇其他的抗性標記物來提高精氨酸產量。

1991年， Aruma等[16]對谷氨酸棒狀桿菌進行NTG處理， 獲得了一株精氨酸高產菌H-7096， 經離子交換柱可獲得52.8 g/L的精氨酸粗結晶。2003年，蘇令鳴等[17]以黃色短桿菌為出發株經NTG誘變和選育， 獲得高產精氨酸菌株AN78， 在20 L發酵罐中培養4d， 產酸率可達61.1 g/L。本研究#13807-111-55是精氨酸產量顯著提高的突變株， 其胞外和總的精氨酸產量分別為(3.19±0.72)、(3.44±0.65) mg/L，遠遠低于工業上精氨酸發酵菌的產量， 因此需要更多的研究來進一步提高藍藻精氨酸產量。首先， 本研究選育抗6-氮尿嘧啶突變株并沒有顯著提高精氨酸產量， 因此可以通過選育抗其他藥物， 例如抗精氨酸氧肟酸、抗磺胺胍、抗L-刀豆氨酸等的突變株來進一步提高精氨酸產量。其次， 由于#13807-111-55能利用葡萄糖異養生長， 因而可以通過不斷優化培養條件， 達到高密度培養的目的， 提高精氨酸產量。第三， #13807-111-55是精氨酸分泌突變株， 能利用硝酸鹽和亞硝酸鹽合成精氨酸并分泌到培養液中， 便于精氨酸的提取純化。因此#13807-111-55是一株潛在的用于生物脫硝同時分泌精氨酸的藻株。

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