厭氧發酵液中微好氧功能菌的分離與鑒定

龔艷麗 李珊珊 李 寧 呂育財 郭金玲 龔大春 田毅紅

(1. 三峽大學 生物與制藥學院， 湖北 宜昌 443002; 2. 三峽大學 水利與環境學院， 湖北 宜昌 443002)

目前，隨著生物質能的普遍利用，沼氣發酵技術被廣泛地應用于農作物秸稈、高濃度有機廢水、餐廚垃圾、人畜糞便、污水處理廠剩余污泥等廢物的資源轉化處理，帶來了巨大的經濟和環境效益[1-2]．產甲烷菌在沼氣發酵、有機廢棄物處理以及全球大氣中的甲烷釋放等過程中扮演著重要的角色，它具有極強的抗菌能力，使傷寒桿菌、霍亂弧菌等致病菌難以生存，在消化處理期間將所有病原體和蟲卵幾乎殺死．

甲烷發酵研究已有一百多年的歷史，從19世紀末到20世紀初，許多國家的微生物學者對纖維素的發酵進行研究，發現在厭氧條件下，纖維素和其他有機物發酵產生的沼氣(主要成分為甲烷)，是微生物在其中起作用的結果．沼氣發酵所需要的環境是絕對厭氧，起主要作用的產甲烷菌屬于專性厭氧菌，它要求環境的氧化還原電位極低，最適氧化還原電位Eh為-330V[3]．產甲烷菌生活環境為極端環境，只能利用氫氣、二氧化碳、一氧化碳、甲酸、乙酸、甲醇及甲基胺等簡單物質產生甲烷和組成自身細胞物質[4]．大部分不產甲烷菌為好氧菌，而大部分產甲烷菌為厭氧菌[5-6]．不產甲烷菌能將復雜的大分子有機物變成簡單的小分子量的物質．他們的種類繁多，依據其作用機制來分，有纖維分解菌，半纖維分解菌，淀粉分解菌，蛋白質分解菌，脂肪分解菌和一些特殊的細菌，如產氫菌，產乙酸菌等．影響不產甲烷菌活性的因素很多，其中溫度的影響最大[7-9]．

由于長期應用的原因，對于糞便和高濃度有機廢水的厭氧消化處理中的產甲烷菌研究較多，所以加強對不產甲烷菌的研究很有必要[10]．而國內外對產甲烷菌的研究較多，對不產甲烷菌尚少報道，因此，本研究的最終目的就是希望獲得這種菌種，掌握它們的理化性質，再將它們應用于上述污水處理廠剩余污泥的厭氧消化、有機廢棄物堆肥或填埋的處理中時，可以通過已知知識控制工藝流程，提高甲烷發酵全過程的速率．可使上述的廢水處理不但可以順利進行，而且在降低投資成本、節省運行費用、節約能源、提高處理效率等方面發揮積極的作用．

1 材料與方法

1.1 微好氧功能菌的分離和純化

菌種從本實驗室高溫(55°C)沼氣發酵體系(發酵原料為蔬菜廢葉)中分離獲得，配制固體基礎培養基：分析天平(AR2140型梅特勒.托利多儀器有限公司)稱量牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂16 g，蒸餾水1 L，調節pH為7.0，置于立式滅菌鍋(上海申安LDZX-75KBS)中121℃滅菌30 min．取少量發酵液，用無菌水將其稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7系列濃度，充分搖勻．分別吸取0.5 mL于相應稀釋濃度的培養皿內，倒置于40℃恒溫培養箱(上海新苗QHX-250BSH)內培養24 h．然后將分離得到的菌種采用平板劃線法[11]進行純化．

1.2 微好氧功能菌革蘭氏染色的測定

先用草酸銨結晶紫染色液初染，革蘭氏碘液媒染，體積分數為95%的乙醇脫色，番紅溶液復染，具體過程按說明書操作．最后通過高倍電子顯微鏡觀察．

1.3 功能菌生長繁殖最適溫度及pH的測定

菌種來源于上述分離純化所得的純化功能菌，采用液體基礎培養基．實驗的溫度梯度設計為30℃、35℃、40℃、45℃和50℃，pH值梯度設計為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5．將上述分離純化所得的純化功能菌分別接種于不同pH的培養基中，放在同一個溫度條件下培養．24 h后，用紫外分光光度計(北京瑞利UV-2601)測其OD600．

1.4 功能菌生長曲線的測定

菌種來源和培養基成分同1.1實驗材料中的一致．培養條件：溫度為40℃，培養基的pH值為7.0．在超凈臺里，用滅菌過的250 mL錐形瓶各裝100 mL無菌水，用接種環從保存功能菌的斜面中挑取一環菌種，在100 mL的無菌水中混勻．用移液槍按1%(菌液體積比培養基體積)的接種量將菌液接種于滅菌過的液體培養基內，接種完成后置于振蕩器里，將溫度調至40℃振蕩培養．取樣周期為8 h一次[12-14]，每次取樣1 mL置于10 mL的離心管內，加入9 mL的無菌水稀釋十倍，紫外分光光度計測其OD600．

1.5 功能菌碳源耐受度的測定

采用液體基礎培養基，去掉原培養基中的牛肉膏，以外加碳源作為培養基的碳源．本實驗按照單糖、雙糖及多糖設計，并考慮到實際生活中，甲烷發酵的對象是含有纖維素、淀粉、半纖維素等有機物，所以選擇D-阿拉伯糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、纖維素、淀粉這6類碳源作為研究對象．6種碳源的質量濃度梯度為5、10、15、20 g/L．在超凈臺里用3個滅菌過的250 mL錐形瓶各裝100 mL無菌水．用接種環從保存功能菌的斜面中挑取一環菌種，在100 mL的無菌水中混勻．用移液槍按1%(菌液體積比培養基體積)的接種量將菌液接種于滅菌過的液體培養基內，接種完成后置于振蕩器里，將溫度調至40℃振蕩培養,培養24 h后取樣．24 h后，取樣1 mL置于10 mL的離心管內，加入9 mL的無菌水稀釋10倍，測其OD600．

1.6 功能菌的保藏和測序鑒定

固體基礎培養基藥品同1.1分離材料一致,在固體基礎培養基凝固前分裝于15個試管中，每株菌保存于5個斜面．分裝后將試管用棉塞密封好置于立式濕式滅菌器中滅菌30 min．將試管取出斜放，保證斜面高度在試管總高度的1/2～1/3之間．再用接種環挑取純化的菌株接種于斜面上，標記后于4℃的冰箱中冷藏保存．細菌的活化采用液體基礎培養基，從保存功能菌的斜面中挑取菌種接種于滅菌過的培養基中．接種完畢后置于振蕩器中40℃振蕩培養24 h，取樣、密封送至檢測中心測序．

2 結果與討論

2.1 微好氧功能菌分離、純化的變化

培養24 h后，取出培養基觀察，各個菌落的大小相當理想，可以根據明顯的菌落特征判別不同菌株．同時說明在后續試驗里，培養周期采用24h是合理的．選擇每個梯度菌落分布均勻的培養皿進行菌株分離．由圖1可得到4株菌落特征明顯不同的菌種，分別將這四株菌編號為1號、2號、3號和4號．

如表1所示，通過對4株菌的菌落特征進行比較：1號菌含水率較高，菌落大；2號菌的含水率最高，表面濕潤光滑，但菌落??；3號菌表面濕潤程度與1號菌類似，邊緣特征異于1號菌；4號菌是4株菌中含水率最低的，表面干燥．

表1 功能菌的純化結果

經過6次純化，2號菌無法達到純化要求，因此將2號舍棄．如圖1所示，1號、3號和4號菌經過純化實驗后，純度極高，培養基內的各個菌落形態特征一致．選擇單菌落，將其保存用于下面的實驗研究．實驗采用斜板保存法將3株菌保存，斜板保存的菌株作為后續實驗的菌種來源，最后分別將斜板保存的菌株置于4℃冰箱中保存．

圖1 有效菌株純化

2.2 微好氧功能菌的革蘭氏染色變化

通過高倍電子顯微鏡觀察，如圖2所示，1號、3號和4號革蘭氏染色菌為紫色，說明三株菌均為革蘭氏陽性菌．

圖2 革蘭氏染色鏡檢圖

2.3 功能菌生長繁殖最適溫度及pH的變化

如圖3所示，1號、2號和4號菌株的最適生長溫度都為40℃，最適pH值都為7．

圖3 各功能菌最適溫度及pH

在溫度為30℃時，三株菌的數量均在pH為7.0達到峰值，但是1號菌在pH為7.0這個點上升速度極快，說明在30℃時，pH的改變對1號菌生長的影響較大．在溫度為35℃時，三株菌有一個共同點，在pH為6.5-7.0以及pH為8.5時，細菌數量變化幅度極大，這種陡變說明在此溫度條件下，三株菌所需要的生長環境是中性或弱堿性．在溫度為40℃時，1號菌和3號菌的pH變化曲線圖類似，在pH為7.0這個點出現峰值，細菌數量增長速度快；4號菌在此溫度條件下，pH值對4號菌的影響力要?。跍囟葹?5℃時，隨著pH值變化，1號菌的數量變化速度平緩，pH所造成的影響不大；3號菌在7.0～7.5之間，數量增長相當，說明在此溫度下，3號菌在中性或偏弱堿性適宜生長；4號菌在pH大于7.0時，數量明顯下降，說明45℃時，4號菌在弱酸性或者中性適宜生長．在溫度為50℃時，1號菌、3號菌和4號菌在pH為8.5這個點基本停止生長，說明在50℃、pH=8.5這個條件下，對三株菌新陳代謝、生長繁殖有了極強的抑制作用．

2.4 功能菌生長曲線的變化

理論上細菌的生長曲線一般分為適應期、加速期、對數期、減速期、靜止期、衰亡期6個時期，按照這6個時期對三株菌的生長曲線做如下分析．

由圖4可知，1號菌、3號菌和4號菌的靜止期相同，都是在0～8 h時段，細菌數量變化不大．根據0時刻的數據顯示，三株菌的接種量幾乎一致，隨著時間的推移，1號菌的生長繁殖速率比3號菌和4號菌快，達到穩定后，1號菌的數量峰值明顯高于其他兩株菌．4號菌的數量峰值最小，但是峰值出現最快，在16～24 h時段就出現了，其次是1號菌，4號菌在32～40 h時段才出現峰值，但細菌總量高于4號菌低于1號菌．靜止期出現后，三株菌均出現衰減，1號菌衰減量很少，并且在40 h點以后達到穩定；3號菌的衰減速度是最快的，但細菌總量仍高于4號菌低于1號菌；4號菌在24～32 h衰減速率較快，而后期衰減速率平緩；衰減穩定后，1號菌的細菌總量最高，3號菌次之，4號菌最低．通過比較，1號菌的生長繁殖能力最強且存活率最高；3號菌的生長周期最長但衰減速率最快；4號菌的數量峰值最早出現但生長繁殖能力弱于其他兩株菌．

圖4 各功能菌的生長曲線比較

2.5 功能菌碳源耐受度的變化

當以D-阿拉伯糖作為外加碳源時，對于1號菌，最適生長的D-阿拉伯糖是15 g/L，但整體觀察可得，D-阿拉伯糖的濃度變化對1號菌生長影響不大．3號菌最適生長D-阿拉伯糖濃度是15 g/L．對于4號菌，20 g/L條件下最高，說明高濃度的D-阿拉伯糖對4號菌的生長抑制不明顯．當以葡萄糖作為外加碳源時，1號菌最適葡萄糖濃度為10 g/L，3號菌最適生長的葡萄糖濃度為10 g/L．4號菌最適葡萄糖濃度為15 g/L．當以乳糖作為外加碳源時，1號菌和4號菌適合在高濃度乳糖環境生長．3號菌最適生長的乳糖濃度范圍在10～15 g/L之間．當以麥芽糖作為外加碳源時，1號菌最適生長的麥芽糖濃度是10 g/L．當麥芽糖濃度大于15 g/L時，細菌數量大致相同，說明在1號菌對高濃度麥芽糖的分解利用率低．3號菌是適合在較高濃度的麥芽糖環境中生長．對于4號菌麥芽糖的濃度變化對4號菌的影響不大，說明在分解麥芽糖的過程中，4號菌可以以麥芽糖作為碳源，但利用率不高．當以纖維素作為外加碳源時，1號菌對纖維素利用分解能力比較弱，低濃度纖維素環境適合1號菌生長繁殖．3號菌的最適生長纖維素濃度是10 g/L．高濃度纖維素環境對3號菌的生長繁殖有極大的抑制作用．4號菌的數量受纖維素濃度影響?。斠缘矸圩鳛橥饧犹荚磿r，1號菌生長速度與淀粉溶液濃度呈正相關．3號菌與1號菌類似，其生長速度與淀粉溶液濃度呈正相關．當淀粉濃度在5～10 g/L之間時，細菌生長速度明顯高于纖維素濃度在10～20 g/L之間時的生長速度，說明淀粉濃度的提高對3號菌生長有促進作用．由4號菌的生長曲線可得最適生長淀粉濃度為15 g/L．雖然4號菌適于在高濃度淀粉條件下生長，但是當淀粉濃度過高時，對4號菌的生長仍有抑制作用．

圖5 最適生長碳源濃度

2.6 功能菌的測序鑒定

對3株菌進行測序，其中1號菌由于取樣配送過程中處理不當，導致純度達不到測序要求，無法測得1號菌的類型．對3號和4號菌的測序結果見表2．

表2 3號和4號菌株相似度比對

圖6 3、4號菌的系統發育樹

經過測序鑒定，3號菌和4號菌均為芽孢桿菌屬．芽孢桿菌屬是一類產芽孢的革蘭氏陽菌，好氧或兼性厭氧生活．根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》第8版中的芽孢桿菌的分類概況，列數了48種芽孢桿菌，其中有26個沒有得到廣泛認可[15]．3號菌與已知的芽孢桿菌的基因相似度達到100%，4號菌與已知的芽孢桿菌的基因相似度達到99%．如圖，雖然3號菌和4號菌的相似度極高，在分析系統發育樹時將兩株菌分在了同一分支上．但根據對3號菌和4號菌理化性質的測定結果，發現3號菌和4號菌存在一定的差異．

16S rRNA測序鑒定的最小單位是屬，比屬小的分類單位有亞屬、種、亞種，所以需要更先進的技術來判斷3號菌和4號菌的關系．

3 結 論

1)實驗初期分離得到4株菌，分別為1號菌、2號菌、3號菌、4號菌，在純化實驗階段，由于2號菌無法達到我們預想的純度，所以選擇舍棄．后期實驗主要對1號菌、3號菌及4號菌的理化性質進行研究．

2)理化性質主要研究內容是革蘭氏染色、最適生長溫度及pH、生長曲線．三株菌的革蘭氏染色的顯色結果均為紫色，屬于革蘭氏陽性菌．三株菌的最適生長溫度是40℃，最適生長pH值為7．通過生長曲線圖觀察到，1號菌的生長周期為2 d，3號菌的生長周期為2 d，4號菌的生長周期為1 d．

3)探究功能菌的最適生長碳源濃度，所選碳源為D-阿拉伯糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、纖維素及淀粉．對于6類碳源，不同濃度條件下,不同菌株的生長情況也有極大區別，三株菌的相似之處是對于以淀粉的分解利用率極高，對于麥芽糖的分離利用率低．

4)最后將三株菌送至上海檢測中心測序．三株菌中，1號菌由于取樣操作處理的不當，導致純度不夠，無法進行提取DNA進行測序；3號菌和4號菌經過測序，鑒定為芽孢桿菌屬．

參考文獻：

[1] 岑承志，陳 礪，嚴宗誠，等．沼氣發酵技術發展及應用現狀[J]．廣東化工，2009，36(6)：78-79．

[2] 李興杰．沼氣發酵技術的研究[J]．農業與技術，1998(3)：20-21．

[3] 楊 光，向 陽，夏 雷．沼氣發酵微生物研究發展[J]．微生物學通報，2003，25(4)：32-61．

[4] 王寶玉，劉建民，韓作穎，等．產甲烷菌的分類及研究進展[J]．基因組學與應用生物學，2014，33(2)：418-425．

[5] 楊 光，向 陽，夏 雷．沼氣發酵微生物研究發展[J]．微生物學通報，2003，25(4)：32-61．

[6] 楊彥希，尹 萍，楊惠芳．沼氣發酵微生物菌群的研究現狀[J]．微生物學通報，1995，22(4)：208-211．

[7] Rene Alvarez，Gunnar Liden． Low Tempreture Anearobic Digestion of Mixture of llama，Cow and Sheep Manure for Improved Methane Production． Enzyme and Microbial Technology[J]． Biomass and Bioenergy，2009，33(1)：527-533．

[8] 張 魏，楊翔華，洪 新，等．沼氣越冬技術研究發展[J]．遼寧石油化工大學學報，2004，24(1)：42-71．

[9] Gallet C，Winte J． Mesophilic and Thermophilic Anearobic Digestion of Source-sorted of Ganic Wastes：Effct of Ammonia on Glucose Degradation and Methane Production [J]． Appl Microbiol Biotechnol，1997，48(1)：405-410．

[10] 周孟津．沼氣發酵原理及工藝[J]．太陽能，1993(10)：20-23．

[11] 張 嫻，王士芬，唐賢春，等．活性污泥中細菌的分離、純化與培養[J]．實驗室科學，2012(8)：1672-4305．

[12] 郭春葉，龔月生，劉林麗，等．酵母菌生長曲線的測定及其轉葡萄氏合酶基因重組菌遺傳穩定性的監測[J]．安徽農業科學，2007，35(7)：1909-1910．

[13] 顧淑萍，劉 正，宋培智．乳桿菌的生長曲線和世代時間測定[J]．上?？谇会t學，1998，7(4)：226-227．

[14] 任曉燕，周 霞．糞腸球菌生長曲線的測定[J]．畜牧獸醫雜志，2005，34(5)：10-11．

[15] 劉國紅，劉 波，林乃銓，等．芽孢桿菌的系統進化及其屬分類學特征[J]．福建農業學報，2008，23(4)：436-449．