2016—2017年蘇州市人感染 H7N9禽流感病毒HA基因進化分析

雅雪蓉 董澤豐 夏瑜 沈強

215004蘇州市疾病預防控制中心

2013年3月在華東地區首次發現人感染H7N9病毒病例[1],病毒全基因序列分析表明H7N9病毒是新型多源重組禽流感病毒[2]。2013年以來該病毒每年冬春季都會在中國大陸造成不同程度的流行,目前中國已經經歷了五個流行季[3]。世界衛生組織官網(http：//www.who.int/csr/don/23-may-2017-ah7n9-china/en/)數據顯示,截至2017年5月13日,已經報告了1 486例實驗室確診病例,總體病死率約為39.4%(586/1 486),并且出現了一些聚集性病例,不能排除病毒具有有限的人傳人的可能。第五波的H7N9流行季實驗室確診的病例數超過了以往任何1次[4-5],引起了廣泛的社會關注。

蘇州位于長三角中部,是H7N9病毒的主要流行地區之一。自從2013年4月份蘇州市確診首例本地人感染H7N9病例后,每個流行季蘇州都會受到不同程度的影響。為了解蘇州地區H7N9病毒的流行特征,本研究采用Real-time PCR技術對2016年10月份至2017年5月份間蘇州地區疑似病例咽拭子標本進行了H7N9病毒核酸檢測,H7N9病毒核酸陽性標本送中國疾控預防控制中心進行病毒分離和基因序列測定。

1 材料與方法

1.1 樣本來源2016年10月份至2017年5月份期間,采集不明原因肺炎病例咽拭子樣本,同時收集患者人口學基本數據、可疑暴露史、發病日期以及主要臨床癥狀等信息。

1.2 病毒檢測參照QIAsymphony Viral/Bacteria Mini Kit試劑盒說明書提取樣本核酸。按照A/B流感病毒通用Real-time PCR檢測試劑盒說明書檢測流感病毒RNA。A型陽性樣本再檢測pdmH1N1,H3,H5N1,H7N9以及H9N2亞型流感病毒。反應條件均為：50℃ 30 min,95℃ 5 min,95℃ 15 s,55℃ 40 s。所有樣本24 h內完成檢測,H7N9核酸檢測陽性樣本-80℃凍存。

1.3 HA基因測序H7N9病毒分離和HA基因測序在國家流感中心P3實驗室進行,將200μl病毒核酸檢測陽性樣本接種到9～11日齡SPF級雞胚尿囊腔,35℃培養72 h。收獲尿囊液樣本并提取病毒核酸用于基因測序。

1.4 HA基因序列分析同源矩陣分析采用DNASTAR軟件,多序列比對使用ClustalX2軟件,MEGA6.0軟件建立HA基因序列系統進化樹,方法為Neighbor-Joining,bootstrap=1000。HA全基因參考序列來自GISAID數據庫。NetNGlyc 1.0 server用于預測HA蛋白的糖基化位點。

2 結果

2.1 病例特征2016年10月份至2017年5月份,蘇州疾病控制中心共確診了55例人感染H7N9禽流感病毒患者,死亡22例,總體病死率為40%(22/55)。83.6%(46/55)的病例在發病前10 d內直接接觸過活禽或暴露于活禽市場.如圖1所示,H7N9病毒主要在冬春季流行,蘇州市H7N9病毒第五波流行季較以往開始的早,確診的病例數也有明顯增加。在第五波 H7N9確診病例中,男性占比為72.7%(40/55),中位年齡為58歲(24～89歲)。職業分布中以退休老人和農民居多。所有病例發病時均伴有高燒(39.4℃,37.8～42℃)和咳嗽等臨床癥狀。

圖1 2013—2017年蘇州市H7N9確診病例時間分布Fig.1 Time distribution of patients infected with H7N9 virus in Suzhou city from 2013 to 2017

2.2 HA基因核酸序列分析蘇州分離到的H7N9病毒血凝素HA基因全長1 683 bp,如圖2所示,H7N9禽流感病毒有兩大分支,分別為長三角分支(Yangtze River Delta)和珠三角分支(Pearl River Delta)。HA基因系統進化樹表明蘇州分離株均屬長三角分支,與A/Zhengjiang/1/2017(H7N9)等華東地區其他地方第五波流行季分離到的病毒同源性最高。與前幾波流行季分離的病毒有共同的祖先,但是分屬不同的進化分支,與本市在2013年第一波H7N9流行季分離的病毒株A/Suzhou/3/2013(H7N9)也不在同一分支上,這表明H7N9病毒仍在不停的進化。此次蘇州分離株HA基因同源性為98.7%～100%。與候選疫苗株A/Shanghai/02/2013(H7N9)的HA基因的核酸序列一致性為97.6%～98.1%。所有蘇州分離株HA基因核酸序列1 014位和1 015位之間沒有核苷酸插入,沒有發現類似A/Guangdong/SP440/2017和A/Taiwan/1/2017等的高致病性突變株。

圖2 蘇州市2016—2017年第5波H7N9疫情病毒分離株HA基因進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of HA gene of H7N9 viruses isolated from the fifth wave in Suzhou city from 2016 to 2017

2.3 氨基酸序列分析2016—2017年流行季分離到的蘇州株HA蛋白的受體結合位點(RBS)關鍵氨基酸沒有改變。與A/Shanghai/02/2013(H7N9)序列相比,所有蘇州分離株T168 A,G195 V,Q235 L和G237S(H7 Numbering)等RBS中關鍵位點氨基酸沒有發生突變。H7N9病毒的受體結合偏好性也沒有發生改變,仍具備與 SA-α2,3-Gal和 SA-α2,6-Gal結合的能力。廣東地區分離到的高致病性突變株A/Guangdong/SF003/2016(H7N9)血凝素切割位點的氨基酸序列為PEVPKRKRTAR↓GLF,但是所有蘇州分離株HA1和HA2之間切割位點的氨基酸序列仍為PEIPKGR↓GLF(333～342),337位和338位之間沒有發現RKRT四個氨基酸的插入,血凝素連接肽氨基酸序列并未發生改變,說明在蘇州地區流行的H7N9病毒對禽類仍然是低致病性的。

2.4 HA蛋白的糖基化位點分析根據NetNGlyc軟件的分析結果,HA蛋白總共有5個潛在的糖基化位點,其中HA1有3個,HA2有2個。5個潛在的糖基化位點分別是30(N-G-T)、46(N-A-T)、249(N-D-T)、421(N-W-T)和493(N-N-T)。與候選疫苗株A/Shanghai/02/2013(H7N9)相比,蘇州分離株HA蛋白潛在糖基化位點的數量和位置沒有發生改變。

3 討論

蘇州人感染H7N9禽流感病毒的病死率為40%,與全國數據(39.4%)相比差異無統計學意義(P＞0.05),遠高于季節性流感。由于第五波H7N9疫情發生時間早,分布地域廣,確診感染人數多等原因,引起廣發的社會關注[3]。此次疫情尚未完全結束,蘇州目前也正遭受H7N9病毒的影響。在蘇州市人感染H7N9病毒的主要途徑是接觸活禽或暴露于活禽市場,H7N9病毒的檢出高峰在春節前1個月,這可能與此時處在活禽消費高峰,人們暴露于活禽或活禽市場的機會增加有關,此外,冬季氣溫較低,H7N9病毒在外環境中存活時間較長也可能是感染人數增加的原因。在此波疫情中,H7N9病毒的流行特征沒有發生明顯改變一致,與之前的研究結果[6-8]。

與季節性流感病毒偏好結合SA-a-2,6-Gal受體不同,禽流感病毒偏好結合SA-α-2,3-Gal受體[9-10]。禽流感病毒必須突破種間屏障,能夠與SA-a-2,6-Gal有效結合才能感染人類。而病毒能否與SA-a-2,6-Gal結合主要影響因素是由受體結合位點中關鍵氨基酸。研究表明禽流感病毒RBS中T168 A,G195 V,Q235 L和G237S(H7 Numbering)突變能夠增加病毒與人類受體的結合能力[11-14]。與候選疫苗株A/Shanghai/02/2013(H7N9)相比,蘇州分離株在這些關鍵氨基酸位點沒有發生突變,這表明H7N9病毒目前還不具備在人際間持續傳播的能力。

HA基因序列分析結果表明所有蘇州分離株均為長三角分支,并且H7N9病毒仍在不停的進化。第五波流行季中臺灣和廣東地區出現了高致病性突變株,發現HA蛋白的切割位點插入了RKRT四個氨基酸,使原本對禽類低致病的H7N9病毒突變為對禽類高致病性[5],這對家禽養殖業將產生重要影響。但是,目前所有蘇州分離株的HA蛋白切割位點氨基酸序列并未發生改變,蘇州地區流行的H7N9病毒對禽類仍然是低致病性的。

流感病毒糖基化位點的減少有利于病毒免疫逃避以及與受體的結合[15-16]。研究表明H7N9病毒HA蛋白頭部糖基化位點的改變會對病毒的適應性產生影響[17]。蘇州H7N9病毒分離株HA蛋白潛在的糖基化位點沒有發生可使病毒傳播能力增強的改變。

值得警惕的是,已經有一些聚集性H7N9病例被證實[18-20],在每起聚集性疫情中,僅有2～3個確診病例,未有3代病例出現。蘇州在第五波H7N9疫情中也發現了一起家庭聚集性病例,與之前的聚集性疫情相似,僅1對有血緣關系的父女兩人被確診感染H7N9病毒,其他密切接觸者均未感染,表明H7N9病毒僅具有有限的人傳人能力。

本研究初步討論了蘇州市第五波H7N9病毒疫情的流行情況及病毒HA基因的分子特征?？傊?人感染H7N9病毒是散發事件,絕大多數病例之間沒有流行病學聯系?；蚍治霰砻鞑《镜膫鞑ツＪ讲⑽窗l生改變,但是為有效應對潛在的大流行,仍有必要密切監測病毒可能出現的變異并進行深入研究。

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