下咽部鱗狀細胞癌患者人乳頭瘤病毒感染及p53蛋白表達的檢測分析

魏煒 宋蘊韜 徐國輝 肖康 石琦

100142北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所頭頸外科惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室(魏煒、宋蘊韜、徐國輝)；102206北京,中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所傳染病預防控制國家重點實驗室(肖康、石琦)

頭頸部腫瘤(head and neck cancer,HNC)是世界上最常見的第六大腫瘤,每年大約有600 000例新確診病例。90%以上HNC為鱗狀細胞癌,主要包括唇、口腔、鼻咽、口咽、下咽和喉癌。傳統觀念認為HNC發病與吸煙及飲酒有關。最近研究發現人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染與HNC發病密切相關[1]。下咽鱗狀細胞癌(hypopharynx squamous cell carcinoma),是原發于下咽部的惡性腫瘤,其以鱗狀細胞癌為主(95%以上),易發部位從高到低依次為梨狀窩、環后區、咽后壁[2]。下咽癌發病率較低,雖然各國存在較大差異,但總體年發病率僅約為0.17～0.80/10萬,占頭頸部惡性腫瘤的1.4%～5.0%,占全身惡性腫瘤的0.2%～0.3%。雖然其發病率并不高,但早期發病往往沒有明顯癥狀,待癥狀明顯時往往已經進入中晚期,且浸潤性較強,惡性程度較高,半數下咽癌確診時已有淋巴結轉移,是頭頸外科中預后差的惡性腫瘤之一。而且下咽癌死亡率較高,5年生存率僅有30% ～50%[3]。本研究采用Luminex及PCR雜交技術以及免疫組織化學方法檢測下咽部鱗狀細胞癌組織中的HPV的感染率以及類型,同時檢測p53蛋白表達及突變的情況,為進一步闡明下咽癌的發病機制提供依據。

1 材料方法

1.1 資料來源15例病例均來自北京腫瘤醫院頭頸外科2008—2011年收集的下咽癌患者標本。

1.2 樣本DNA提取參照文獻從腫瘤組織的石蠟包埋標本中切取5片10μm厚的切片,放入管中加入1 ml的二甲苯,室溫振蕩浸泡2 h。之后將溶解的樣品放入帶有濾膜的離心管中,離心后再加入1 ml的乙醇震蕩混勻洗去雜質,離心后按照試劑盒(德國Qiagen公司)的操作說明進行樣本DNA的提取,最終將樣品DNA溶解于50μl的體積中,-20℃備用[4]。

1.3 HPV DNA Luminex檢測應用HPV DNA分型測定試劑盒(TellgenplexTMHPV DNA檢測試劑盒)檢測樣本組織中提取的DNA是否存在HPV的感染。此試劑盒應用Luminex技術,可以檢測樣本中19 種高危型 HPV 類型(HPV-16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、55、56、58、59、66、68、82 及 83)及7 種低危型 HPV 類型(HPV-6、11、40、42、44、61及73)的存在。具體步驟如下,取2μg提取的DNA進行PCR雜交反應,條件為95℃ 30 s,58℃ 30 s及72℃ 30 s進行最初的5個循環,之后95℃ 30 s,55℃ 30 s及72℃ 30 s進行第二輪的35個循環。以此PCR產物進行快速雜交反應后應用Bio-Plex200系統進行Lunimex結果的檢測,對HPV的感染類型進行檢測,并且應用TellgenplexTM公司相應的試劑盒數據分析軟件進行數據分析[5]。

1.4 高危型HPV16/18 PCR檢測以及p53基因檢測及測序分析以樣本提取的DNA為模板對HPV16、18型進行兩輪PCR檢測。引物序列分別為HPV16-1(5’-GCAAGCAACAGTTACTGCGA-3’)及P16-2 (5 ’-CAACAAGACATACATCGACC-3 ’)；HPV18-1(5’-CACTTCACTGCAAGACATAGA-3’)及P18-2(5’-GTTGTGAAATCGTCGTTTTTCA-3’)。 第一輪PCR條件：1.0μg DNA作為模板,1μmol/L的上下游引物及1.25 U Pfu DNA聚合酶,共25μl體系；反應條件：94℃ 60 s,57℃ 60 s及72℃ 60 s,共30個循環,之后72℃ 延伸10 min。第二輪PCR條件：第一輪產物取5μl作為模板,10μmol/L的上下游引物及1.25 U Pfu DNA聚合酶,共25μl體系；反應條件：94℃ 60 s,52℃ 60 s,72℃ 60 s,共40個循環,之后72℃ 延伸10 min。PCR反應嚴格在PCR實驗室分區操作,以240 bp大小的actin作為參照。HPV DNA的PCR產物以2%的瓊脂糖凝膠進行分析并且用凝膠回收試劑盒對目的片段進行回收。以相同的引物,應用ABI PRISMTM3730XL大型DNA測序儀進行序列測定分析。

p53的5-8外顯子應用傳統的PCR方法進行擴增。在50μl擴增體系中包括1μl的DNA模板、20pmol的上下游引物、25μl的PCR Mix以及21μl無RNA酶的水。PCR的反應條件如下：95℃ 30 s,65℃ 退火45 s,之后每循環降低1℃,55℃進行35個循環,最后72℃延伸45 s。所有的PCR實驗都在專用的PCR實驗室中進行,避免DNA的污染[6]。

1.5 HPV16/18E6蛋白及p53蛋白免疫組織化學檢測石蠟包埋的病變部位組織塊切成5μm厚的切片,按下列步驟處理：切片在二甲苯中脫蠟5 min并逐漸進行水化,3%H2O2-甲醇處理15 min以除去內源性過氧化物酶。在酶消化進行抗原暴露和修復后切片用1%正常羊血清封閉20 min,然后將HPV16/18E6單克隆抗體(Abcam公司)或者p53非磷酸化單克隆抗體(Novus公司)按1∶500稀釋在4℃作用過夜,然后與1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶結合的羊抗鼠二抗室溫作用1 h,DAB顯色。切片用蘇木素復染、脫水以及用封片劑進行封片觀察。

2 結果

2.1 患者HPV DNA的檢測結果經過26種型別HPV基因Luminex檢測,發現2例同時出現HPV16/18感染陽性的病例,未發現低危型HPV病毒的感染。通過二輪PCR的檢測,1例病例出現HPV18感染陽性,3例病例出現HPV16感染陽性,經測序比對分析序列正確,基因檢測的陽性率為40.0%(6/15)。

2.2 患者HPV蛋白表達的檢測結果經HPV16/18E6蛋白抗體進行免疫組織化學檢測,在15例病例中發現2例HPV感染陽性,檢測陽性率為13.3%(2/15)。在免疫組織化學的檢測中可以觀察到病變組織的鱗狀上皮中有棕色的陽性顆粒出現,為表達的HPV16/18E6蛋白(見圖1)。綜合HPV基因及蛋白檢測結果,15例下咽癌患者中HPV基因及蛋白檢測總陽性率達到46.7%(7/15)。

圖1 下咽部鱗狀細胞癌組織HPV16/18E6抗原蛋白的免疫組織化學染色(×20/×40/×100)Fig.1 Immunohistochemistry assays of HPV16/18E6 proteins in the tissues from patients with hypopharynx squamous cell carcinoma(×20/×40/×100)

2.3 患者病理分級及HPV感染陽性率在15例下咽癌病例中,高分化的病例有4例,其中2例為HPV陽性,陽性率50.0%；中分化的病例有7例,其中5例為HPV陽性,陽性率71.4%；低分化的病例有4例,未發現HPV檢測陽性病例。

2.4 患者臨床分級及HPV感染陽性率在15例下咽癌病例中,1例為臨床分級I級,為HPV感染陽性病例；7例為臨床分級II級,其中3例為HPV感染陽性,占到42.9%；6例為臨床分級III級,其中2例為HPV感染陽性,占到33.3%；1例為臨床分級IV級,為HPV感染陽性病例。

2.5 患者的性別、年齡分布,是否吸煙、喝酒及淋巴結轉移情況在15例下咽癌病例全部都是男性,其中HPV陽性患者及全部病例的年齡中位數分別為58歲/60歲；在7例HPV陽性的下咽癌患者中,全部具有吸煙史,占到100%(7/7)；5例具有飲酒史,占到71.4%(5/7)；3例具有淋巴結轉移,4例沒有淋巴結轉移。

2.6 患者p53蛋白表達及其基因突變情況p53蛋白在腫瘤組織中的表達通過免疫組織化學的方法來檢測,棕色的陽性顆粒主要分布在惡性細胞的細胞核(見圖2)。在下咽癌的15份標本中,6份為陽性標本,占到病例數的40.0%(6/15)。另外,在15例下咽癌患者中通過PCR的方法發現9例患者存在p53基因突變,占到60.0%(9/15),其中在外顯子5出現突變的有2例病例,在外顯子6出現突變的有1例病例,在外顯子7出現突變的有2例病例,在外顯子8出現突變的有3例病例,另外有1例病例在外顯子6和7同時出現突變。

圖2 下咽部鱗狀細胞癌組織p53蛋白的免疫組織化學染色(×20/×40/×100)Fig.2 Immunohistochemical assays of p53 suppressor proteins in the tissues from patients with hypopharynx squamous cell carcinoma(× 20/×40/×100)

3 討論

HPV是一種具有高度組織親嗜性,主要侵犯人類皮膚及黏膜鱗狀上皮的病毒,迄今共發現有200多種病毒亞型,根據致病力劃分為低危型和高危型兩大類。其中高危型HPV能使鱗狀細胞無限增殖進而癌變,所致腫瘤有宮頸癌、外陰癌、頭頸部腫瘤等,代表亞型有 HPV16、18、31、33 等[7]。 目前還沒有一種被認為是HPV檢測的標準方法,但PCR方法是應用最多的HPV檢測方法,它是通過擴增標本中的HPV DNA片段來達到檢測目的,具有非常高的靈敏性,最少能檢測到1拷貝HPV DNA細胞水平,然而一般PCR不能判斷HPV DNA是來自標本中的腫瘤組織還是腫瘤周圍的間質組織,也不能判斷HPV DNA在宿主細胞中的部位和狀態,由于PCR對HPV DNA部位和狀態判斷的低特異性以及假陽性限制了PCR為HPV檢測的標準方法[8]。因此在本研究中,同時應用PCR方法對HPV基因以及免疫組織化學方法對HPV表達的蛋白進行檢測,提高HPV病毒檢出率。

p53基因,一種腫瘤抑制基因,在細胞面對各種外界刺激包括凋亡、周期變化、衰老、DNA修復、細胞代謝及自噬過程中都起著重要的作用。p53功能的喪失及突變在很多腫瘤的發生中都導致了p53活性及增殖活性的下降以及無限制的生長。人類腫瘤中大多數p53的突變都是錯義突變,并且集中在5～8外顯子上。在很多病例中,這些突變可以引起抑癌功能的喪失或者引起癌基因功能的獲得。本課題組之前對喉癌病例的研究中發現了p53蛋白的過表達,因此,在本研究中也通過PCR的方法對p53的突變進行了檢測,同時應用免疫組化的方法對p53蛋白的表達進行檢測[9],出現了40%的蛋白陽性率以及60%的基因突變率。

在頭頸部腫瘤中,HPV不同的暴露機會可能會導致感染率的不同。HPV通過口腔黏膜進行傳播的確切機制還不清楚,但是皮膚與皮膚之間的直接接觸被認為是必須的條件[10]。同時,頭頸部腫瘤發生的部位和HPV的感染率可能也有一定的關系[11]。國外學者報告下咽鱗狀細胞癌中也有一定的HPV檢出率,但研究不多,結果差異大,目前缺乏統一的結論,且有效病例較少[12]。而我國人群的大樣本量報道很少,報道病例研究資料不足。在協和醫院對14例下咽癌患者HPV檢測結果中,HPV的感染率為57.1%[12-13],與本研究組的結果相近。在本研究的15例下咽癌病例中,HPV感染陽性率為46.7%,陽性率較高,與本實驗中應用了3種方法對HPV的感染進行檢測有關,不同的方法敏感性不同,對HPV病毒的基因和表達蛋白同時檢測提高了檢測的靈敏性。但由于樣本量較少,也未發現HPV的感染與是否具有淋巴結轉移有關。在應用PCR方法以及Luminex方法對HPV感染的類型進行檢測的結果發現,HPV感染的類型均為高危型的HPV16或者HPV18,有2例病例同時出現了HPV16及HPV18的感染,與近期的報道結果相一致。在本研究中,未發現下咽癌的發生與患者的臨床分級、病理分級、是否吸煙飲酒以及是否具有淋巴結轉移具有相關性。有待于在下一步的研究中,繼續擴大樣本量,進一步研究HPV感染與非感染的下咽癌患者之間的生存率的差異。

利益沖突無