熒光標記的米糠多糖及其細胞攝入研究

潘顯虎，虞鴻玉，吳淑恒，劉梁

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023）

米糠作為稻米加工的副產物，是一類具有廣泛開發潛力的高附加值資源，近些年來受到國內外研究學者的廣泛關注[1]。從米糠中提取出來的多糖，由于其結構的特殊性，使其具有多種生物活性[2]。如增強免疫、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等活性，可用于藥品、功能型食品的開發[3]。但由于米糠多糖的分子量較大，水溶性較差等導致我國對其功能的研究和開發相對不足。本研究通過對米糠多糖進行熒光標記，得到米糠多糖-羅丹明 B（Rice Bran Polysaccharide-Rhodamine B，RBPRh B）和米糠多糖-異硫氰酸熒光素（Rice Bran Polysaccharide-Fluorescein isothiocyanate，RBP-FITC）兩種熒光標記物，解決米糠多糖本身缺少易于檢測發光基團的難題，為進一步研究多糖的生物學活性提供一種新型可靠的輔助手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Lambda 25型紫外分光光度計：PerkinElmer公司；NICOLET iS10紅外分光光度計：美國賽默飛世爾公司；970CRT熒光分光分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；DF-1CD磁力攪拌油浴鍋：金壇市億能實驗儀器廠。

米糠多糖：制藥工程實驗室自制并純化；95%乙醇、無水乙醇、乙醚、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氰基硼氫化鈉、溴化鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；羅丹明 B（Rhodamine B，Rh B）：天津市北聯細化學品開發有限公司；酪胺（2-（4-Hydroxyphenyl）ethylamine，Tyr）：上海笛柏化學品技術有限公司；異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）：山東西亞化學工業有限公司；DMEM/HIGH GLUCOSE（DMEM培養基）、磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）：HyClone公司；胰蛋白酶-EDTA溶液（胰酶）、Penicillin-Streptomycin（雙抗）：百替生物公司；人宮頸癌細胞Hela：華中師范大學農藥與化學生物學教育部重點實驗室惠贈。

1.2 方法

1.2.1 米糠多糖總糖含量測定

米糠多糖中總糖含量采用硫酸-苯酚法測定[4-5]。稱取葡萄糖0.04 g加蒸餾水定容于500 mL容量瓶中，得到0.08 mg/mL的葡萄糖標準溶液，分別取葡萄糖標準溶 液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 mL 于 試管中，補水至2 mL，依次加入1 mL6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸，反應5 min后置于沸水浴中反應20 min，取出待冷至室溫時用紫外分光光度計測定490 nm處的吸光度值A1，以不加葡萄糖溶液的試管為空白組，測得吸光度值A0。以葡萄糖溶液的濃度梯度為橫坐標，對應的吸光度值A1-A0為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。取一定濃度的米糠多糖溶液代替葡萄糖溶液測得吸光度值A，計算出米糠多糖中總糖的含量。

1.2.2 RBP-Rh B和RBP-FITC的制備

1.2.2.1 RBP-Rh B復合物的制備

RBP-Rh B復合物的制備采用張中北等[6]的方法，精確稱取米糠多糖與羅丹明B各20 mg，溶于10 mL蒸餾水，在避光的條件下攪拌反應24 h，將反應后的樣品避光流水透析7 d，在透析后的溶液中加入3倍量體積的無水乙醇，溶液中出現暗紅色沉淀物質，靜置使沉淀完全。沉淀分別用95%乙醇、無水乙醇、各洗滌一次，干燥后得到RBP-Rh B復合物。

1.2.2.2 RBP-FITC的制備

米糠多糖的胺化[7-8]，稱取米糠多糖0.5 g溶于15 mL的0.2mol/L的PBS（pH8.0），分別加入400 mg酪胺與150 mg氰基硼氫化鈉，在37℃的條件下攪拌反應96 h，將反應后溶液離心取其上清液，將離心后的溶液用自來水透析2 d，在透析后的溶液中加入3倍量體積的無水乙醇，溶液中出現紅棕色沉淀物質，靜置使沉淀完全。沉淀分別用95%乙醇、無水乙醇、各洗滌1次，干燥后得到米糠多糖-酪胺（RBP-Tyr）復合物。

RBP-FITC的制備[9-10]，將RBP-Tyr加水溶解，用0.5 mol/L的NaHCO3溶液調pH至8.5，加入FITC在室溫條件下避光攪拌反應12 h，將反應后的樣品避光流水透析7 d，在透析后的溶液中加入3倍量體積的無水乙醇，溶液中出現黃綠色沉淀物質，靜置使沉淀完全。沉淀分別用95%乙醇、無水乙醇、各洗滌1次，干燥后得到RBP-FITC復合物。

1.2.3 RBP-Rh B和RBP-FITC的表征

1.2.3.1 理化性質分析

取少量的RBP-Rh B和RBP-FITC固體，加蒸餾水溶解，分別取一滴溶液于載玻片上，室溫避光干燥，將干燥后的樣品置于熒光顯微鏡下觀察[7]。

1.2.3.2 紅外光譜分析

取米糠多糖、羅丹明B、FITC、RBP-Rh B和RBPFITC粉末與溴化鉀壓成薄片[11]，用紅外分光光度計掃描測定。

1.2.3.3 紫外光譜分析

紫外光譜分析確定反應成功[12]。稱取米糠多糖、羅丹明B、FITC、RBP-Rh B和RBP-FITC粉末1 mg溶于蒸餾水并定容至10 mL，得到0.1 mg/mL的樣品溶液。以水為空白對照，用紫外分光光度計對各樣品進行200nm～700 nm范圍掃描。

1.2.3.4 熒光光譜分析

稱取羅丹明B、FITC、RBP-Rh B和RBP-FITC粉末1 mg溶于蒸餾水并定容至10 mL，得到0.1 mg/mL的樣品溶液。選擇羅丹明B和FITC紫外光譜的最大吸收峰處作為熒光掃描的激發波長，用熒光分光光度計對各樣品進行掃描。其中羅丹明B和RBP-RhB的激發波長（Ex）562 nm，發射波長（Em）掃描范圍 350 nm～700 nm；FITC和RBP-FITC的激發波長495 nm，發射波長掃描范圍450 nm～700 nm[13]。

1.2.4 熒光取代度的測定

1.2.4.1 紫外分光光度法

參照文獻[12]的方法，取配制好的0.01 mg/mL的RhB 溶液 20、40、80、120、160、200 μL 于試管中，加水至5 mL，用紫外分光光度計測定554 nm處的吸光度值A1。以RhB的濃度為橫坐標，A1為縱坐標得到標準曲線。取一定濃度的RBP-Rh B溶液測定其吸光度A，計算出RBP-Rh B的熒光取代度。

取配制好的0.01 mg/mL的FITC溶液10、20、30、40、50 μL于試管中，加水至5 mL，用紫外光分光光度計測定495 nm處的吸光度值A1。以FITC的濃度為橫坐標，A1為縱坐標得到標準曲線[14]。取一定濃度的RBPFITC溶液測定其吸光度值A，計算出RBP-FITC的熒光取代度。

1.2.4.2 熒光分光光度法

稱取1 mg的羅丹明B，加水溶解至濃度為0.01 mg/mL的儲液，分取羅丹明B溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于試管中，補水至5 mL，用熒光分光光度計在Ex=562 nm，Em=610 nm條件下測定其熒光強度F1。以RhB的濃度為橫坐標，F1為縱坐標得到標準曲線[9，15]。取一定濃度的RBP-Rh B溶液測定其熒光強度F，計算出RBP-Rh B的熒光取代度。

稱取1.0mg的FITC，加水溶解至濃度為0.01mg/mL的儲液，分取 FITC 溶液 5、10、15、20、25 μL 于試管中，補水至5 mL，用熒光分光光度計在Ex=495 nm，Em=550 nm條件下測定其熒光強度F1。以FITC的濃度為橫坐標，F1為縱坐標得到標準曲線[16-17]。取一定濃度的RBP-FITC溶液測定其熒光強度F，計算出RBP-FITC的熒光取代度。

1.2.5 細胞攝取

1.2.5.1 細胞培養

在試驗期間將Hela細胞培養在含有10%FBS、1%雙抗的DMEM培養基中，放入37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，待細胞達到80%～90%匯合度時，吸去培養基，用PBS潤洗后加入胰酶消化，將消化下來的細胞進行傳代處理[18]。待細胞傳至3代～4代后可以進行細胞試驗。

1.2.5.2 細胞毒性試驗

取匯合度達到80%～90%的細胞，用胰酶消化分散后，均勻的鋪于96孔板中，使得各孔細胞數約為1.5×104個，置于37℃，5%CO2的條件下培養24 h。用DMEM培養基將米糠多糖、RBP-Rh B和RBP-FITC溶解成濃度為 0、0.1、0.2、0.3、0.4 和 0.5 mg/mL 溶液，將96孔板中的細胞在此濃度梯度下處理24 h，向每孔中加入10 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續培養4 h后，吸除培養液，用DMSO溶解生成的晶體，并用酶標儀測定570 nm處的吸光值，以未加樣品處理的孔作為空白對照組，計算細胞存活力[18]。

1.2.5.3 細胞攝取試驗

對文獻的方法進行改進[19-21]，分別稱取RBP-Rh B和RBP-FITC粉末10 mg，加水溶解定容至10 mL，得到1 mg/mL的儲液備用。待細胞達到80%～90%匯合度時，對細胞進行胰酶消化處理，將胰酶消化處理的細胞均勻鋪到24孔培養板中，保證每孔細胞數為105個，在37℃，5%CO2條件下培養24 h，吸去培養基，用PBS潤洗2遍后，每孔加入400 μL DMEM培養基，向各孔中加入100 μL RBP-Rh B溶液，并與37℃，5%CO2條件下培養，以不加樣品孔作為空白對照。分別在培養 1、2、3、4、5 h 后，取其中 3 個孔用 PBS 洗去含有樣品的培養基，用胰酶消化后轉入黑色96孔板中，用酶標儀檢測Ex=562.0 nm，Em=610.0 nm處的熒光強度F，待熒光強度達到穩定后，將其余的孔置于熒光顯微鏡下拍照[22]。RBP-FITC的檢測方法同RBP-Rh B，其Ex=495 nm，Em=550 nm。

2 結果與討論

2.1 米糠多糖的總糖含量測定

葡萄糖的標準曲線繪制見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

標準曲線的回歸方程為Y=6.365 88X+0.104 67（R2=0.999 7），米糠多糖中的總糖含量為42%。

2.2 RBP-Rh B和RBP-FITC的表征

2.2.1 理化性質分析

RBP-Rh B和RBP-FITC的熒光顯微鏡圖片如圖2所示。

圖2 熒光圖片Fig.2 Fluorescent picture

圖A1和A2分別是RBP-Rh B在自然光和激發光下的圖片，RBP-Rh B在綠色激發光下發射出紅色熒光；圖B1和B2分別是RBP-FITC在自然光和激發光下的圖片，RBP-FITC在藍色激發光下發射出綠色熒光。證明米糠多糖成功地標記上這兩種熒光物質。

2.2.2 紅外結果分析

紅外光譜圖見圖3。

圖3 樣品的紅外光譜圖Fig.3 IR spectrum of samples

由圖3可知，RBP-Rh B的紅外光譜圖中在1 621 cm-1處出現明顯的特征吸收峰，該處是由米糠多糖還原性末端與羅丹明B活潑的氨基發生反應形成的C-N鍵伸縮振動峰[6，23]，說明米糠多糖成功修飾上熒光物質羅丹明B；RBP-FITC的紅外光譜圖中在1 644 cm-1和1 210 cm-1處出現特征吸收峰，1 644 cm-1是米糠多糖還原性末端的半縮醛基通過還原胺化反應與酪胺的氨基共價偶聯形成的C-N鍵變形振動峰，1 210 cm-1是RBP-Tyr中酪胺引入的仲氨基通過與FITC進行親核反應生成的C-N鍵伸縮振動峰[24-25]，這兩處的特征峰說明了米糠多糖成功修飾上熒光物質FITC。

2.2.3 紫外結果分析

紫外吸收光譜見圖4。

圖4 紫外吸收光譜Fig.4 UV absorption spectrum

由圖4可以看出，羅丹明B和FITC兩種熒光染料分別在553 nm和490 nm處有吸收峰，米糠多糖在400 nm～700 nm范圍內無特征吸收峰，而RBP-Rh B和RBP-FITC分別在553 nm和490 nm處出現吸收峰，說明米糠多糖上均成功的修飾了羅丹明B和FITC這兩種熒光染料。

2.2.4 熒光結果分析

熒光光譜圖見圖5。

由圖5可以看出，羅丹明B和FITC兩種熒光染料的最大發射波長分別在590 nm和550 nm處，而RBP-Rh B和RBP-FITC分別在590 nm和550 nm左右出現熒光吸收，說明米糠多糖成功修飾上羅丹明B和FITC這兩種熒光染料。

圖5 熒光圖譜Fig.5 Fluorescence absorption spectrum

2.3 熒光取代度的測定

2.3.1 紫外法

選擇554nm為羅丹明B含量測定的波長，羅丹明B的濃度在0～0.04 μg/mL范圍內的標準曲線如圖6（A），其回歸方程為Y=0.5847X+0.0001（R2=0.9962），測得RBP-Rh B中的羅丹明B的含量為0.7%；選擇495 nm為FITC含量測定的波長，FITC的濃度在0～0.1 μg/mL范圍內的標準曲線如圖6（B），其回歸方程為Y=0.46X+0.045（R2=0.994 4），測得 RBP-FITC 中 FITC 的含量為0.2%。

圖6 紫外標準曲線Fig.6 UV standard curve

2.3.2 熒光法

選擇Ex=562 nm，Em=610 nm為羅丹明B熒光測定的波長，羅丹明B的濃度在0～1 μg/mL范圍內的標準曲線如圖7（A），其回歸方程為Y=111.6X+10.215（R2=0.994 8），測得RBP-Rh B的熒光取代度為1%；選擇Ex=495 nm，Em=550 nm為FITC熒光測定的波長，FITC的濃度在0～0.05 μg/mL范圍內的標準曲線如圖7（B），其回歸方程為 Y=3 129.7X+13.121（R2=0.998 1），測得RBP-FITC的熒光取代度為0.3%。

圖7 熒光標準曲線Fig.7 Fluorescence standard curve

2.4 細胞毒性結果分析

樣品的細胞毒性結果如圖8所示。

圖8 樣品的細胞毒性評價Fig.8 Cytotoxicity evaluation of samples

在0～0.5 mg/mL的濃度范圍內，均有80%以上的細胞活力，說明米糠多糖、RBP-Rh B和RBP-FITC均具有很低的細胞毒性。與米糠多糖相比，熒光標記物標記后存在輕微的細胞毒性，幾乎不會對細胞試驗結果造成影響。

2.5 細胞攝取結果

Hela細胞對RBP-Rh B和RBP-FITC的攝取情況見圖9。

圖9 Hela細胞對RBP-Rh B和RBP-FITC的攝取情況Fig.9 Hela cells uptake of RBP-Rh B and RBP-FITC

圖9的熒光圖片可以看出，羅丹明B標記的米糠多糖在綠光激發下使細胞發射出紅光，FITC標記的米糠多糖在藍光激發下使細胞發射出綠光，表明了兩種熒光物質標記的米糠多糖均可以被Hela細胞所攝取。RBP-Rh B和RBP-FITC的細胞攝取結果見圖10。

圖10的熒光值則表明了隨時間的延長，Hela細胞對這兩種熒光物質標記的多糖攝取量也逐漸增大，最終在4 h左右達到攝取的最大值。

3 結論

圖10 RBP-Rh B和RBP-FITC的細胞攝取結果Fig.10 Cell uptake of RBP-Rh B and RBP-FITC

用熒光物質標記米糠多糖的制備工藝簡單，紫外分光光度法測得羅丹明B和FITC對于米糠多糖的標記率分別為0.7%和0.2%，熒光分光光度法測得羅丹明B和FITC對于米糠多糖的標記率分別為1.0%和0.3%。雖然這兩種熒光物質對米糠多糖的標記率不高，但它們在極低的濃度下均含有很高的熒光值，所以用這兩種熒光物質進行標記可以很容易的觀察到細胞攝取情況。本試驗結果表明了米糠多糖可以很好的被Hela細胞所攝取且攝取時間較短，并且熒光標記物修飾后幾乎沒有細胞毒性，為將來進一步的開發和研究米糠多糖及其米糠多糖修飾物提供理論依據。

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