基于GC-MS與多變量分析方法的不同儲藏期 大米揮發特征氣味的分析

康文翠 林 顥 滿忠秀

(江蘇大學食品與生物工程學院，鎮江 212013)

大米作為人類的主食之一，含有豐富的營養物質,是人體主要的熱量來源,與人們的生活息息相關，其品質的好壞直接關系到國計民生[1]。大米在儲存過程中會發生陳化和霉變，從而影響大米的食用性，其中霉變可通過調整自身水分含量使其得到控制，而陳化卻伴隨始終，無法消除[2]，因此需要對大米的陳化進行檢測。趙迎等[3]通過建立新陳大米拉曼光譜判別模型，提供了一種新的快速判別稻谷新陳度的方法。郭玉寶等[4]為探究大米陳化過程中品質隨時間的變化規律，利用的是快速粘度分析儀(RVA)和電子鼻。楊慧萍等[5]的研究表明不同溫度和水分條件下大米陳化過程中脂肪酸值與氣味有R=0.917的顯著相關性關系。Tananuwong等[6]研究分析了有機香米在儲藏期間的揮發性氣體的變化。Bryant等[7]用頂空固相微萃取-氣質聯用方法分析了芳香和非芳香稻谷品種之間揮發性物質的差異。Sirisoontaralak等[8]用氣相色譜質譜聯用技術研究了輻照大米理化性質和香味的變化。大米在陳化過程中的揮發性成分能一定程度上代表其劣變的程度，人們常根據氣味、色澤、質地等來判斷大米是否陳化，但這種感官評定法有著主觀性強，準確度低的不足?；诶砘笜朔矫?，車海先等[9]以比色法判定稻谷的新陳度，周延智等[10]利用酸堿指示劑在稻谷提取液中所顯色的差別，通過肉眼快速定性稻谷的脂肪酸值來估計其陳化程度。而Setyaningsih等[11]采用愈創木酚快速檢測法與氣味感官評定能較好的實現新陳米的區分，以及袁貝等[12]通過紅外光譜印證了大米陳化過程中有機化學物質的變化。

本研究根據揮發氣體來探究對大米新鮮度的檢測方法。采用GC-MS對兩種不品種的大米(蘇軟香型米和武育粳米)在陳化過程中揮發性成分的分析，通過主成分分析結合方差分析檢測不同品種大米陳化過程中的特征揮發氣體，并采用線性判別分析和聚類分析等多種分析方法，建立一種對不同儲藏時間的大米揮發性物質的簡單而系統鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

蘇軟香型米優選福臨門蘇北蘇軟香的大米，原糧產自素以優質稻米聞名的江蘇魚米之鄉。武育粳米為蘇常武育粳香型軟米，產自地處江蘇省南部隸屬于常州市的武進。GC-MS氣質聯用分析儀，SPME萃取頭(安譜，75 μm CAR/PDMS)，DB-WAX 彈性毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)

1.2 樣品制備

本實驗所用的大米樣品有蘇軟香型和武育粳兩個品種，均在溫度為20～25 ℃，濕度為30%～40%的自然環境下儲藏時間分別為0、2、4、6、10個月，每個儲藏期的大米各有10個樣本，每個樣本100 g。

1.3 實驗方法

實驗前，先將SPME萃取頭(安譜，75 μm CAR/PDMS)在氣相色譜的進樣口于300 ℃老化至無雜峰。然后稱取8.0 g大米樣本置于15 mL的萃取瓶中，并加入10 μL， 2.424 g/L的4-甲基-2-戊醇作為內標，蓋上蓋子，固體NaCl的作用是促進大米中揮發性氣體的揮發。將萃取瓶置于80 ℃恒溫水浴中，振蕩頻率為250 r/min。將SPME萃取頭通過瓶蓋插入到樣品的頂空部分，推出纖維頭，頂空吸附30 min。吸附完成后，抽回纖維頭，并將萃取頭從萃取瓶中拔出，再將萃取頭插入GC-MS儀的氣相色譜進樣口，推出纖維頭，于250 ℃解吸5 min，完成樣品的進樣。

GC條件：DB-WAX 彈性毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣He流量0.8 mL/min，不分流，進樣口溫度250 ℃。柱溫：起始溫度35 ℃，以5 ℃/min升溫至100 ℃，然后以3 ℃/min升溫至200 ℃，再以10 ℃/min升溫至220 ℃，保持15 min。

MS條件：接口溫度230 ℃，離子源溫度220 ℃，電離方式EI+，電子能量70 eV，掃描質量范圍33～450 amu。通過HP-Chemstation System工作站采集和處理數據。

1.4 數據分析方法

相關性分析是指對兩個或多個具備相關性的變量元素進行分析，從而衡量兩個變量因素的相關密切程度。相關性的元素之間需要存在一定的聯系或者概率才可以進行相關性分析，對于不同儲藏時間的大米，揮發性成分種類和數量各不相同，但其之間可能存在某種依存關系，本研究將對具體有依存關系的現象探討其相關方向以及相關程度[13-14]。

主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)是一種統計方法。通過正交變換將一組可能存在相關性的變量轉換為一組線性不相關的變量，轉換后的這組變量叫主成分(Principal components，PCs)。利用主成分分析可以從大量的原始數據中提取有效的信息，從而直觀的反映不同儲藏時間大米樣本的趨勢[15-16]。

在已知研究對象分成若干類型，并已取得各種類型的一批已知樣品的觀測數據，在此基礎上根據某些準則建立判別式，然后對未知類型的樣品進行判別分類的一種分析方法，即為線性判別分析(LDA)[17]。LDA分析是在進行PCA分析之后，對GC-MS測定的揮發性物質進一步分析，進而反映不同儲藏時間大米的差異情況。線性判別分析相比于主成分分析來說更加注重樣品在空間中的分布規律及各樣品間的距離分析[18-19]。

聚類分析是能夠將一批樣本按照它們在性質(變量)上的親疏程度在沒有先驗知識的情況下自動進行分類的分析方法[20]。聚類分析的目標就是在相似的基礎上收集數據來分類[21]。本文在此原理的基礎上，按照大米樣本的儲藏時間和種類分別依次由小類到大類進行聚類。

2 結果與分析

2.1 GC-MS的分析結果

2.1.1 蘇軟香型米和武育粳米主要揮發性成分含量的方差分析[22]

根據GC-MS的分析結果，得出從不同儲藏時間的蘇軟香型米中共檢測出的揮發性成分主要包括醇類、醛類、酮類、烷烴類、醚類、雜環類化合物。如表1是蘇軟香型米在存儲過程中一些主要揮發性成分的相對含量的方差分析結果，可以看出各種揮發性物質的含量都在不斷變化，有增多有減少。不同儲藏期的蘇軟香型米中的壬醛和丙酮含量存在顯著性差異，且呈現一定的規律性，在儲藏時間為4個月時2-乙基己醇、壬醛、2-甲基丁醛、正己醛的含量都呈現一個過渡的趨勢，隨著時間的延長，醛類的含量有明顯的增加，大米散發出新米沒有的異味。對于武育粳米，如表2所示是其主要揮發性成分的方差分析結果。在存儲過程中武育粳米產生的2-甲基丁醛物質的含量也呈現出一定的規律性，即由新米到4個月的陳米，2-甲基丁醛的含量顯著降低，繼續陳化后，在儲藏到10個月的過程中，2-甲基丁醛含量逐漸增多，在此過程中，正己醛的含量表現出相反的規律變化，即以4個月儲藏時間為過渡點，正己醛的含量先增多后減少。由此，2-甲基丁醛和正己醛可作為表征武育粳米不同儲藏時間的標志性氣體。

表1 蘇軟香型米不同儲藏期的揮發性成分的差異方差分析表

表2 武育粳米不同儲藏期的揮發性成分的差異方差分析表

不同的字母代表顯著性差異；

2.1.2 蘇軟香型米和武育粳米在陳化過程中揮發性成分的種類變化

圖1是蘇軟香型米和武育粳米在不同儲藏時間內的各種揮發性成分的種類變化圖。從圖1中可以看出，2種米在陳化過程中通過GC-MS測得的揮發性成分種類是不斷變化的，對于購買不久的蘇軟香新米，有著更多含量的醇類、醛類和烴類，其中直鏈高級醇有著草木味、水果味和花香味[23]，而相應的烴類為新大米的香味起一定的烘托作用。2個月的蘇軟香型米揮發性成分的種類和含量比其它儲藏時間的都要少，隨著時間的延長，醚類物質的種類增多，使大米有刺鼻的米糠味。對于武育粳米在其新鮮時，檢測到的揮發性成分最多，有醇類、醛類、酚類、酯類、酮類、烷烴類、烯烴類、醚類、雜環類。隨著儲藏期的延長，武育粳米散發出的揮發性成分種類在減少且比蘇軟香型米的少。當在10個月的儲藏期測出的揮發性成分種類有所增多，其中有9種烷烴類質和4種醚類物質，這也是和陳化的大米有著不悅的氣味有關，說明大米在不同時間散發出不同的氣味，而氣味的濃烈和揮發性有機物質有關，而揮發性有機物質可能還與大米的種類有關。

注：1～12分別表示醇、醛、酚、酯、酮、烷烴、烯烴、酸、醚、苯環、雜環、其他等類的揮發性成分。

圖1 不同儲藏時間的大米揮發性成分的種類

2.2 揮發性成分間的相關性分析

為了了解不同儲藏時間的大米其揮發性成分含量的相關性，本研究分別對蘇軟香型米和武育粳米在不同儲藏時間的各個有機揮發性成分間含量進行相關性分析，通過相關系數R判斷相關關系密切程度。蘇軟香型米的結果見表3，2個月的揮發性成分中2-乙基己醇和壬醛含量，2-甲基丁醛和丙酮含量相關性顯著，儲藏時間為4個月時，2-乙基己醇和正己醛含量也有顯著相關性，相關系數R均大于 0.5。當儲藏時間為10個月時，蘇軟香型米的揮發性成分中2-甲基丁醛和壬醛含量顯著相關，且和丙酮含量成較高顯著相關性，相關系數為0.644?？赡芤驗楸菂⑴c生物細胞進行呼吸作用代謝的TCA循環上的有機物質。如表4是武育粳米揮發性成分含量間的相關性分析結果?？梢钥闯鲂旅桩a生的2-乙基己醇和2-甲基丁醛，壬醛和正己醛其含量均存在相關性，而且此時的2-乙基己醇和丙酮，以及2-甲基丁醛和正己醛、丙酮含量間存在相關系數R大于0.6的顯著相關性。這可能與武育粳米自身香味有關。當武育粳米儲藏四個月的時候，其壬醛和2-乙基己醇、壬醛含量間相關性顯著。

表3 不同儲藏時間的蘇軟香型米揮發性成分含量之間的相關性分析

表4 不同儲藏時間的武育粳米揮發性成分含量之間的相關性分析

*表示相關性顯著，α<0.05；**表示相關性高度顯著，α<0.01

2.3 主成分分析

將兩種大米實驗分析得到的揮發性成分作為輸入分別各自進行主成分分析。得到主成分載荷因子圖和主成分分析圖。由2種米的每種揮發性氣體的前3個主成分系數分別得到載荷因子圖[24]，見圖2和圖3，可以看出對不同儲藏時間的蘇軟香型米的貢獻率較高的物質有壬醛，2-甲基丁醛，正己醛，2-戊基呋喃，而區分不同儲藏時間的武育粳米比較重要的標志性化學物質有1-辛烯-3醇，正己醛，18-冠醚-6，丙酮，15-冠醚-5。

大米是一個組成復雜且具有活性的有機體，在儲藏過程中依然進行著微弱的生命活動。在大米的主要成分中，脂肪和酶的變化最為顯著，雖然脂肪比淀粉含量與蛋白質含量低得多，但在儲藏期間大米品質陳化的主要原因卻在于脂質物質的氧化[25]，由于脂質的進一步氧化，生成了低級的醛、酮化合物和飽和脂肪酸類。由于大米組分的這種復雜性，同時組分之間在儲藏的過程中的相互作用，使得大米的穩定性及品質發生一定的變化，除了可以表現為氣味和色澤、米粒結構方面的變化，同時也可以表現為大米的揮發性氣味發生一系列的改變，這點與對不同儲藏時間的蘇軟香型米和武育粳米的貢獻率較高的物質有關。

圖2 蘇軟香型米陳化過程中揮發性氣體的前3個主成分系數的載荷因子圖

圖3 武育粳米陳化過程中揮發性氣體的前三個主成分系數的載荷因子圖

圖4是不同儲藏期(0、2、4、6、10個月)蘇軟香型米(a)和武育粳米(b)的揮發性氣體的主成分分析圖，累計方差貢獻率分別達到了93.96%和94.44%，均大于90%，說明所受干擾較小，所這 3 個主成分能較好的反應原始高維矩陣的信息[26]，可以反映蘇軟香型米和武育粳米在各儲藏時間的揮發性物質有所不同。從圖4可知，不同儲藏時間的蘇軟香型米和武育粳米基本都可通過主成分分析直接區分開。

圖4 不同儲藏期的蘇軟香型米(a)和武育粳米 (b)揮發性氣體的主成分分析圖

2.4 線性判別分析(LDA)

圖5是蘇軟香型米(a)和武育粳米(b)在不同主成分數下的線性判別分析(LDA)識別率，從圖5可以看出，模式的識別率隨著主成分的增加而增加，對于蘇軟香型米，當主成分數為3時，模型即可取得良好的識別效果，訓練集和預測集中LDA模型區分不同儲藏時間的大米準確率分別為100% 和94.12%; 當主成分數為4時，模型的整體識別率最好，此時，模型對訓練集和預測集中樣本的識別率均為100%。在主成分數在為3時，訓練集和預測集中LDA模型區分不同儲藏時間的武育粳米準確率分別為93.94%和94.12%，當主成分數為為6時，模型對訓練集和預測集中樣本的識別率均達到100%。

圖5 蘇軟香型米(a)和武育粳米(b)不同主成分 數下的LDA判別分析識別率

2.5 聚類分析

本研究采用歐式距離(Euclidean distance)判別變量間的相似性，即兩樣本之間的距離是各樣本每個變量值之差的平方和的平方根，度量小類與小類間的親疏程度采用離差平方和法(Ward ’Method)，以各個批次的大米編號作為自變量，以其陳化過程中壬醛，2-甲基丁醛，正己醛，2-戊基呋喃，1-辛烯-3醇，正己醛，18-冠醚-6，丙酮，15-冠醚-5的含量作為因變量，利用SPSS軟件(16.0)進行聚類分析，結果見圖6。

從圖6的聚類分析可以看出，在距離5處，所有批次的大米被分為三個集合(cluster)(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。第一類包含了SRX2-1～10、SRX4-1～10、SRX6-1～10、SRX10-1～10，分別代表了儲藏期為2、4、6、10個月的蘇軟香型米，第二類包含了SRX0-1～10，即為蘇軟香型新米，第三類包含了WYJ0-1～10、WYJ2-1～10、WYJ4-1～10、WYJ6-1～10、WYJ10-1～10，表示的是儲藏期分別為0、2、4、6、10個月的武育粳米?？梢钥闯?，基本上可以較為明顯地區分開兩種類型的大米，而儲藏期為0個月的蘇軟香型米獨立成為一類，可能與蘇軟香型新米氣味單一有關，而且在上述GC-MS實驗過程中，蘇軟香型新米在上述8種標志性揮發性物質中僅有2-甲基丁醛一種成分。在臨界值為0.5處，樣本可以被分為十個集合，基本上是各個儲藏期的兩種大米獨自成一個集合，與主成分分析得到的結果一致，可以較好地區分開不同類型的不同儲藏期的大米。在蘇軟香型米和武育粳米儲藏到十個月的過程中，其自身的呼吸代謝、微生物、霉菌、蟲蛀等問題都將引起大米品質的陳化，而對于蘇軟香型米和武育粳米兩種不同種類的大米，其內部結構、理化形狀及生物化學特性的不同決定著它們的儲藏特點是會發生不同程度的陳化。除此之外，儲藏時間越長，大米越易發生陳化。

圖6 兩種大米在不同儲藏期的化學成分的系統聚類

3 結論

由GC-MS分析出的結果，看出蘇軟香型米和武育粳米在五個儲藏期都分別檢測出十二大類物質，包括醇類、醛類、酚類、酯類、酮類、烷烴類、烯烴類、酸類、醚類、苯環類、雜環類和其他類化合物。但兩種大米在不同儲藏時間的揮發性物質各不相同，其中蘇軟香型米中共檢測出83種揮發性成分，武育粳米中檢測出52種揮發性成分。通過主成分分析方法，可以基本區分開福臨門蘇北蘇軟香的大米和蘇常武育粳香型軟米兩個品種的不同批次的大米，對于區分不同儲藏時間的這兩個品種的貢獻率較高的物質分別有壬醛，2-甲基丁醛，正己醛，2-戊基呋喃；和1-辛烯-3醇，正己醛，18-冠醚-6，丙酮15-冠醚-5。通過建立LDA模型，分析得出兩種米對訓練集和預測集中樣本的識別率最終均能達到100%。結合聚類分析，可以較好地將5個儲藏時間的兩種類型的大米分為3個集合，即蘇軟香型新米，蘇軟香型陳米和武育粳米，還可以得到不同儲藏時間的大米的分類結果。

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