α-突觸核蛋白對小鼠星形膠質細胞的激活作用*

王進堂 ，Jeremy Walston，Peisong Gao，高茂龍 ，Sean X Leng，陳崢

（1.北京老年醫院 老年病臨床與康復研究所，北京 100095；2. Division of Geriatric Medicine and Gerontology, Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine，Baltimore 21224, USA; 3. Johns Hopkins Asthma and Allergy Center, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore 21224, USA）

α-突觸核蛋白（α-synuclein, α-syn）正常存在于突觸前神經終端，產生生理功能[1]。其異常代謝或產物被釋放到細胞外基質，激活膠質細胞和固有免疫反應，引起神經元損傷[2-4]，成為某些神經退行性疾病的發病機制之一[5-6]。有證據表明，α-syn突變和聚合可以激活小膠質細胞產生炎癥反應[4，7]，但其對星形膠質細胞的激活作用，目前仍有爭議。本研究利用α-syn及其A53T突變型檢測α-syn對Toll樣受體（toll-like receptors, TLRs） 1～4和核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB, NF-κB）表達的影響，以證實其是否參與星形膠質細胞介導的免疫調節作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12細胞培養劑和胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）購自美國Gibco公司，野生型和A53T α-syn購自美國rPeptide公司，β-Actin初級抗體﹑Alexa Fluor?514羊抗兔二級抗體﹑實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒﹑DAPI核染色劑購自美國Thermo Fisher公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標記二級抗體（美國Cell Signaling公司），TLR-2﹑膠質纖維原酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）﹑NF-κB初級抗體購自美國Abcam公司。

1.2 細胞分離和培養

混合膠質細胞分離于新生（3～4 d）C57BL/6小鼠的大腦皮層，根據細胞黏附程度，將星形膠質細胞與其他細胞，如小膠質和少突膠質細胞分離[8]。取出大腦皮層，經胰蛋白酶消化制成細胞懸浮液，在聚賴氨酸包被的培養瓶及37℃﹑5%二氧化碳CO2﹑95%濕度培養箱中用DMEM/F12（含10% FBS﹑100u/ml青霉素﹑100μg/ml鏈霉素）培育16 h，通過劇烈搖動和清洗，繼續培養3～5 d，然后根據需要分離于多個培養瓶，培養至90%覆蓋時即可使用。

1.3 熒光顯微鏡觀察

在蓋玻片上培養星形膠質細胞，用冰冷的甲醇和丙酮（1∶1）溶液固定5min，予以生理鹽水PBS（pH 7.4）沖洗10～15min，2.25%甘氨酸室溫下作用20min，PBS反復沖洗后包被緩沖液（1%牛血清白蛋白﹑0.3% Triton X-100﹑10%山羊血清）室溫下作用1 h，PBS反復沖洗后用GFAP初級抗體（兔抗鼠1∶1 000）4℃過夜，PBS反復沖洗后用Alexa Fluor?514二級抗體（羊抗兔，1∶1 000）室溫下作用1 h，PBS反復沖洗后用1μg/ml DAPI進行細胞核熒光染色10min。封片后在熒光顯微鏡（日本尼康公司，型號ECLIPSE Ni-U）下檢查。

1.4 細胞藥物處理

將傳代的星形膠質細胞在6孔板上分成多個處理組，替換新鮮培養液，分別加入適當濃度的藥物[7]：2和20μg/ml野生型α-syn﹑A53T突變型，留取0%藥物作為對照，繼續常規培養24 h。然后按分組進行細胞裂解液（0.5 ml/孔Trizol液）的RNA提取和蛋白裂解液（0.2 ml/孔）的蛋白質提取，分別用于qRT-PCR和Western blot檢測。

1.5 qRT-PCR

qRT-PCR測定TLRs 1～4和NF-κB mRNA的表達水平，并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）的表達作為內部參照。在分光光度計（型號NanoDrop? 2000）上嚴格按照美國Applied Biosystems公司提供的TaqMan基因表達分析程序進行測定。目標轉錄物用美國TaqMan公司探針測定：TLR1（Mm01208874_m1），TLR2（Mm00442346_m1），TLR3（Mm00628112_m1），TLR4（Mm00445273_m1），NF-κB（Mm00476361_m1），其相對豐度用GAPDH（Mm03302249_g1）進行標準化處理?；虮磉_改變=ΔCt值-GAPDH參照值，然后計算ΔΔCt和倍數差異數，用于統計學處理。

1.6 Western blot檢測

用Western blot檢測TLR2和NF-κB蛋白的表達，以β-actin作為內部對照。用Bradford試劑（美國Bio-Rad公司）測定蛋白濃度，取30μg蛋白質加熱至95℃變性，經Bio-Rad電泳儀電泳和聚偏二氟乙烯膜半干轉移儀轉膜，進行初級抗體（4℃過夜）和HRP結合二級抗體（室溫1 h）孵育。然后分別用增強化學熒光試劑盒（美國Bio-Rad公司）在暗室顯影。

1.7 統計學方法

數據分析采用SAS 9.1.3統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 星形膠質細胞熒光顯微鏡觀察

本研究提取的星形膠質細胞清除了絕大多數其他細胞類型。免疫熒光分析顯示，不同形態的GFAP陽性細胞代表星形膠質細胞數，DAPI陽性細胞代表細胞總數。在鏡下隨機選取5個視野進行細胞計數，GFAP陽性細胞占（93.96±4.03）%。見圖1。

圖1 星形膠質細胞免疫熒光分析

2.2 α-Syn誘導TLRs的表達

TLRs是固有免疫反應中用于識別各種內源性或外源性抗原的一組受體。經A53T突變型刺激24 h后，2和20μg/ml A53T突變型組與對照組的TLRs 1～4 mRNA表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=4.490﹑7.617﹑7.328和4.031，P=0.027﹑0.005﹑0.009和 0.048）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，2和20μg/ml A53T突變型組TLRs 1～4 mRNA表達水平高于對照組，其中以TLR1 mRNA和TLR2 mRNA增長幅度較大（見圖2）。Western blot檢測結果顯示，當A53T突變型濃度增加到20μg/ml，TLR2蛋白的表達水平升高（見圖3）。結果提示，α-syn誘導和激活星形膠質細胞介導的固有免疫反應。另外，野生型α-syn對TLRs也產生較弱的免疫誘導效應。

2.3 α-Syn誘導NF-κB的表達

NF-κB作為非常重要的轉錄因子，是多種炎癥因子基因表達的上游調節分子，在固有免疫炎癥通路中發揮中樞和核心的調控作用。分別經野生型α-syn﹑A53T突變型處理后，2和20μg/ml A53T突變型組與對照組的NF-κB mRNA表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=4.640和9.810，P=0.047和0.008）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，2和20μg/ml A53T突變型組NF-κB mRNA表達水平高于對照組。其中，經野生型α-syn處理后，20μg/ml A53T突變型組較2μg/ml A53T突變型組NF-κB mRNA表達水平升高幅度較大（P＜0.05）（見圖4）。Western blot檢測結果顯示，當A53T突變型濃度增加到20μg/ml，NF-κB蛋白的表達水平升高（見圖5）。結果提示α-syn能提高NF-κB表達的水平，增加固有免疫反應程度，并且A53T突變型具有較強的刺激活性。

圖2 A53T突變型對TLRs 1～4表達的激活作用 （±s）

圖3 TLR2蛋白的表達

圖4 野生型α-syn及A53T突變型對NF-κB表達的激活作用 （±s）

圖5 NF-κB蛋白的表達

3 討論

大量研究證明，在神經退行性疾病的發病機制中，星形膠質細胞扮演重要角色，其激活固有免疫和炎癥反應，促進神經元毒性微環境的形成[2-3，5]。近年來，在α-syn介導的神經元變性的炎癥病理中，研究的重點都放在α-syn對小膠質細胞的致炎效應上[7，9]，包括TLRs表達和促炎癥細胞因子分泌等，然而其對星形膠質細胞的免疫誘導作用卻很少得到關注。本實驗證實，α-syn及其A53T突變型上調TLRs 1～4和NF-κB的表達水平，且A53T突變型具有較強的誘導效應，揭示α-syn能刺激星形膠質細胞，激活腦的固有免疫反應。

關于α-syn對星形膠質細胞的激活效應，僅有幾篇文獻報道，例如將神經元分泌的α-syn直接作用于星形膠質細胞，誘導炎癥反應，刺激IL-6﹑IL-1β﹑ICAM-1 的釋放和 CXCL10 的表達[8，10-11]。TLRs作為免疫原識別受體也參與神經變性的炎癥病理變化，并且與α-syn誘導的免疫反應密切相關，例如在小膠質細胞，α-syn上調TLR2﹑TLR3和TLR7的表達，并且激活炎癥反應[7，12]，而對NF-κB和TNF-α沒有作用[12]。然而在星形膠質細胞中，α-syn誘導的TLRs激活罕有報道，目前仍不清楚。本研究結果彌補這一事實，證實TLRs 1～4都得到激活。NF-κB作為神經炎癥通路的關鍵轉錄因子，直接參與神經炎癥和神經變性病理變化，這已在小膠質細胞得到證實[13]，同時α-syn也上調小膠質細胞NF-κB的表達[14]。本研究證實，α-syn提高星形膠質細胞NF-κB表達，與其對TLRs的誘導效應是一致的，進一步提示α-syn通過刺激星形膠質細胞，激活腦的固有免疫反應，為神經退行性疾病的致病機制的研究提供了有力的免疫學證據。

綜上所述，α-syn作為神經細胞的異常代謝產物，是一種較強的免疫原物質，增加星形膠質細胞的TLRs活性，提高NF-κB的表達，直接參與對腦固有免疫的激活，并且A53T突變型具有較強的免疫誘導效應，為α-syn參與星形膠質細胞介導的神經退行性疾病的病理機制研究提供了有力的免疫學證據。

致謝 感謝美國約翰霍普金斯大學醫學院Sean Leng教授實驗室提供實驗條件。

參 考 文 獻：

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