金針菇多糖制備過程中體外抗氧化活性研究

張劍，弓志青，賈鳳娟，崔文甲，王月明，王文亮

（山東省農業科學院農產品研究所/山東省農產品精深加工技術重點實驗室/農業部新食品資源加工重點實驗室，山東濟南250100）

金針菇（Flammulina velutipes）別名冬菇、樸菇、構菌、青杠菌、毛柄金錢菌等，在真菌學領域中屬于擔子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口蘑科，金錢菌屬[1]。金針菇因其形美，味鮮，且富含多糖、蛋白質、鈣、鐵、磷、多種維生素等物質，已成為世界上知名的欣賞菌和食藥兩用菌[2]。

金針菇多糖作為金針菇的主要活性物質之一，具有抗氧化[3]、抗衰老[4]、抗病毒[5]、抗腫瘤[6]、提高機體免疫力[7]等多種生理性功效。目前有關金針菇粗多糖或單一多糖組分的生物活性的研究較多[8-10]，而提取分離純化過程中進行多糖活性追蹤的研究較少，鄒宇曉等研究了純化過程中金針菇多糖體外抗腫瘤活性的變化，結果表明，抗腫瘤活性最高的是未經純化處理的金針菇粗多糖，說明分離純化工藝對多糖抗腫瘤活性有影響[11]。對不同純度的多糖樣品進行活性研究，這直接影響到多糖功能食品開發的關鍵工藝，對相關產品的質量控制極為重要。而金針菇多糖制備過程中其抗氧化活性的變化研究還少有報道。

本文以金針菇水提液、醇沉多糖以及脫蛋白多糖為研究對象，以總抗氧化能力、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力及抑制羥基自由基能力為檢測指標，研究3種純度的粗多糖體外抗氧化活性，旨在探討金針菇多糖在制備過程中體外抗氧化活性的變化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電熱恒溫水浴鍋（DK-8D）：上海精宏實驗設備有限公司；電子天平（AR423CN）：奧豪斯（上海）儀器有限公司；高速離心機（LXJ-IIB）：上海安亭科學儀器廠；紫外可見分光光度計（UV6000）：上海元析儀器有限公司；小型粉碎機（ZN-20L）：北京興時利和科技發展有限公司。

金針菇：濟南大潤發超市，產地濟南；DPPH：北京中生瑞泰科技有限公司；考馬斯亮藍：Biosharp公司；牛血清蛋白：Biofroxx；總抗氧化能力測定試劑盒（貨號：A015）、抑制羥自由基能力測定試劑盒（貨號：A018）：南京建成生物工程研究所；其它均為國產分析純。

1.2 樣品制備

將金針菇進行整理去雜后60℃干燥至恒重，粉碎，過80目篩。運用熱水浸提的工藝料液比1∶30（g/mL）、溫度90℃、時間4 h、提取2次，獲取金針菇多糖水提液，冷凍干燥得金針菇多糖水提物，命名為FVP1；通過乙醇沉淀和冷凍干燥得金針菇粗多糖，命名為FVP2；經Sevage法去蛋白和冷凍干燥得到金針菇脫蛋白多糖，命名為FVP3。將FVP1、FVP2、FVP3置于干燥器中備用。

1.3 多糖含量測定

采用苯酚硫酸法聯合3，5-二硝基水楊酸法（DNS）測定金針菇多糖純化過程中的含量，其中苯酚硫酸法測定總糖含量，DNS法檢測還原糖的含量，二者之差即為多糖含量，即多糖含量=總糖含量-還原糖含量[12]。兩種方法均以葡萄糖為標準物質制作標準曲線，以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光值A為縱坐標，所得的回歸方程分別為y=15.614x+0.003 29，R2=0.999 76；y=1.671 6x-0.049，R2=0.999 9。將待測樣品FVP1、FVP2、FVP3配置成合適的濃度按標準曲線的操作進行檢測，根據吸光值計算待測樣品中多糖含量。

1.4 抗氧化試驗

1.4.1 總抗氧化能力檢測

將 FVP1、FVP2、FVP3配置成2.0 mg/mL的試樣，運用南京建成生物工程研究所試劑盒（貨號：A015）測定，詳細步驟按試劑盒說明書進行操作。其原理是：具有抗氧化性的物質可以將Fe3+還原成Fe2+，生成的Fe2+可與菲啉類物質生成穩定的絡合物，通過比色測定便可得知其抗氧化能力高低。定義：在37℃下，每毫升樣品每分鐘使反應體系的吸光值每增加0.01時，即為一個總抗氧化能力單位（U）。計算公式：

式中：反應液總量為3.7 mL；取樣量為0.1 mL。

1.4.2 DPPH自由基清除能力

采用弓志青等的方法[13]，其原理：DPPH自由基上有單電子，溶于醇溶液中呈現紫色，在515 nm～520 nm范圍內有強吸收。自由基清除劑可以與DPPH自由基的單電子配對，導致其吸收逐漸消失，顏色也由深紫色變成黃色。褪色程度與所接受的電子數量成定量關系，因此可用分光光度計來進行定量分析[14]，具體操作：將 FVP1、FVP2、FVP3 分別配置成 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的試樣，加樣順序見表1，室溫避光反應30 min，于517 nm下測定吸光值，并按以下公式計算清除率I。

表1 清除DPPH自由基試驗樣品添加量Table 1 Sample addition for DPPH scavenging test

1.4.3 抑制羥基自由基能力

將 FVP1、FVP2、FVP3 分別配置成 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的試樣，運用南京建成生物工程研究所試劑盒（貨號：A018）測定，詳細步驟按試劑盒說明書進行操作。其原理：依據Fenton反應，H2O2的量與Fenton反應產生的·OH量成正比，當給予電子受體后，加入griess試劑進行顯色，便形成紅色物質，顏色深淺與·OH的多少成正比關系。定義在37℃下1 min反應，使反應體系中H2O2濃度降低1 mmol/L所需的樣品量為1個抑制羥自由基能力單位（U）。

計算公式：

式中：標準品濃度為8.824mmol/L；取樣量為0.2mL。

2 結果與分析

2.1 多糖含量測定

FVP1、FVP2、FVP3中的多糖含量及得率見表2。

表2 多糖含量及得率Table 2 Content and yield of polysaccharide

隨著純化的進行，多糖含量逐漸提高，即FVP3＞FVP2＞FVP1，其中FVP3的多糖含量達55.21%；而多糖的得率卻逐漸降低，即FVP1＞FVP2＞FVP3，其中FVP3的多糖得率僅有1.52%。

2.2 抗氧化試驗

2.2.1 總抗氧化能力

不同純度的金針菇粗多糖總抗氧化能力由總抗氧化能力檢測試劑盒測定見表3和圖1。

表3 純化工藝對金針菇多糖總抗氧化能力的影響Table 3 Effect of purification process on total antioxidant capacity of Flammulina velutipes polysaccharide

圖1 FVP1、FVP2、FVP3的總抗氧化能力Fig.1 Total antioxidant capacity of FVP1，FVP2，FVP3

由表3和圖1可知，2.0 mg/mL的 FVP1、FVP2、FVP3的總抗氧化能力逐漸下降，總抗氧化能力依次為6.221、3.831、1.197 U/mL，這說明純化工藝有降低金針菇粗多糖的總抗氧化能力的趨勢。

2.2.2 DPPH自由基清除能力

不同純度的金針菇粗多糖的DPPH自由基清除能力見表4和圖2。

表4 純化工藝對金針菇多糖DPPH自由基清除能力的影響Table 4 Effect of purification process on DPPH radical scavenging activity of Flammulina velutipes polysaccharide

續表4 純化工藝對金針菇多糖DPPH自由基清除能力的影響Continue table 4 Effect of purification process on DPPH radical scavenging activity of Flammulina velutipes polysaccharide

圖2 FVP1、FVP2、FVP3的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of FVP1，FVP2，FVP3

在0.5 mg/mL～2.0 mg/mL的濃度范圍內，不同純度的FVP1、FVP2、FVP3的DPPH自由基清除能力均具有濃度依賴性，隨著濃度的增高，其能力也逐漸提高，其中FVP1在2.0 mg/mL的濃度下的清除能力最強，為45.69%；在相同的濃度下，DPPH自由基清除能力的大小依次為FVP1＞FVP2＞FVP3，而且隨著濃度的增加，DPPH自由基清除能力的降幅逐漸增大，這說明，純化工藝有減弱金針菇粗多糖DPPH自由基清除能力的趨勢。

2.2.3 抑制羥基自由基能力

不同純度的金針菇粗多糖抑制羥基自由基能力見表5和圖3。

表5 純化工藝對金針菇多糖抑制羥自由基能力的影響Table 5 Effect of purification process on hydroxyl radical restraining capacity of Flammulina velutipes polysaccharide

續表5 純化工藝對金針菇多糖抑制羥自由基能力的影響Continue table 5 Effect of purification process on hydroxyl radical restraining capacity of Flammulina velutipes polysaccharide

圖3 FVP1、FVP2、FVP3的抑制羥基自由基能力Fig.3 Hydroxyl radical restraining capacity of FVP1，FVP2，FVP3

在0.5 mg/mL～2.0 mg/mL的濃度范圍內，不同純度的FVP1、FVP2、FVP3的抑制羥基自由基能力均具有濃度依賴性，隨著濃度的增高，其能力也逐漸提高。其中FVP1在2.0 mg/mL的濃度下的清除能力最強，為98.70%；在相同的濃度下，FVP1與FVP2的抑制羥基自由基的能力相當，變化不是很大，而FVP3的抑制羥基自由基的能力卻大幅度下降。這說明，純化過程中的脫蛋白有減弱金針菇粗多糖抑制羥基自由基能力的趨勢。

3 討論

據報道，金針菇多糖具有抗氧化活性，其主要是通過提高超氧化物歧化酶的活性，進而有效清除自由基，起到抗氧化的作用[8]。葉敏等[15]檢測了金針菇多糖清除羥自由基能力，結果顯示多糖對羥自由基有一定的清除能力，并且具有濃度依賴性；李守勉等[16]采用結晶紫法測定了金針菇多糖清除自由基的能力，結果表明金針菇多糖對羥基自由基有良好的清除效果。本試驗中不同濃度的金針菇多糖均表現出一定的抗氧化能力，尤其是抑制羥基自由基的能力較強。

多糖的活性與很多因素有關，比如相對分子質量、溶解度、結構等的改變均會影響多糖的活性。通常一定相對分子質量的具備三股螺旋結構的β-1，3葡聚糖活性較高[17]。目前金針菇多糖的制備主要通過提取、分離、純化等，步驟繁多，中間還涉及有機溶劑的加入等，金針菇多糖的結構難免不會破壞[8]，而多糖的生物活性很大程度上是由其結構決定的，這就有可能造成其活性下降。另外Seavge法去除蛋白質的過程中會導致多糖的流失，一方面，除去變性膠狀蛋白時會有少量多糖溶于其中；另一方面，有些多糖與蛋白質結合形成糖蛋白或者蛋白聚糖，也會隨著蛋白的變性沉淀下來，造成多糖的損失[18]。另外，有些金針菇多糖還可以與蛋白質結合的形式來發揮其生物活性[19]，蛋白質的去除必然會影響其相應的生物活性。這可能是本研究中FVP3即脫蛋白多糖抗氧化活性最低的原因。

4 結論

本研究中FVP1、FVP2、FVP3粗多糖樣品的得率（相對于金針菇原料）分別為54.9%、9.26%、1.52%，純度逐漸升高，依次為10.35%、19.48%、55.21%；FVP1、FVP2、FVP3均有一定的體外抗氧化活性，其中抑制羥自由基能力最強，DPPH自由基清除能力次之，總抗氧化能力最弱。在本試驗的濃度范圍內，3種純度粗多糖的抗氧化能力呈劑量效應，但抗氧化能力大小卻隨著純度的升高而降低，這說明多糖的分離純化工藝有降低其體外抗氧化能力的影響，尤其是脫蛋白工藝。無論是從生產成本上，還是抗氧化活性上，FVP1較為經濟適用。

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