水稻OsMPK15的cDNA克隆和轉錄水平分析

石佳 楊丹丹 葛慧雯 杜京堯 梁衛紅

（河南師范大學生命科學學院，新鄉 453007）

促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一類絲氨酸/蘇氨酸（Thr/Ser）蛋白激酶，普遍存在于哺乳動物、高等植物和真菌等高等真核生物體內［1］。MAPK的結構和功能在進化中都是高度保守的。由MAPK介導的細胞信號轉導參與了包括細胞分裂、細胞分化以及多種脅迫應答過程，并且MAPK還涉及激素介導的信號通路［2］。

研究顯示，植物的MAPK家族參與了調控植物生長發育的過程，包括配子形成、胚胎發育、形態發生、衰老、脫落、受精和種子的形成［3］。如MAPK家族可以作為受體樣激酶（Receptor-like kinase，RLKs）的下游信號分子參與調節植物的生長發育過程，其中對擬南芥AtMPK3和AtMPK6研究較為深入，其能作為RLKs的下游信號分子參與調節植物生長發育、細胞通訊過程［4-6］。有研究顯示，煙草MAPK級聯信號通路NPK1-NQK1-NRK1在調控細胞分裂中發揮重要的作用［7-9］。植物的MAPK還參與逆境脅迫以及激素信號應答。如擬南芥MAPK級聯反應中，AtMKK1或AtMKK2通過激活下游的AtMPK4，不僅調控水楊酸（Salicylic acid，SA）的積累、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的平衡，還對低溫、高鹽和機械損傷等非生物脅迫也能作出響應［10-12］。

水稻MAPK同樣參與了水稻的生長發育、生物脅迫應答和非生物脅迫應答過程，有些MAPK與調控植物激素信號通路有關，如OsMPK6的活性能被白葉枯病菌的侵染所激活，從而引起抗逆植物激素的積累，活化茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和水楊酸信號通路，進而上調抗病基因的表達量，增強植株局部對白葉枯病菌的抗性［13-14］。OsMPK5參與水稻對高鹽、干旱、紫外、臭氧、重金屬、高溫及低溫脅迫等幾乎所有非生物脅迫應答過程［15-16］；OsMEK1-OsMAP1級聯通路則廣泛參與了水稻的低溫脅迫應答過程［17］。盡管許多MAPK參與水稻的生物與非生物脅迫應答及生長發育過程［2］，但其生物學功能和作用機制仍有待深入研究。

本實驗室前期對水稻MAPK家族成員OsMPK14的研究顯示，該基因參與多種水稻非生物脅迫應答過程［18］，水稻功能未知基因OsMPK15與其同源性最高。為此，本研究擬克隆OsMPK15的cDNA編碼區，并通過qRT-PCR技術檢測OsMPK15的表達特性，旨為后續的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻材料為粳稻品種日本晴（Oryza sativa L.

japonica.cv. Nipponbare）?？寺≥d體pEASY-T載體和高純度質粒小提試劑盒購自北京全式金有限公司，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α由河南師范大學生命科學學院植物發育分子細胞生物學實驗室保存。TRIzol總RNA提取試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒 SYBR PrimeScript RT-PCR Kit、SYBR?Premix Ex TaqTM、限制性內切酶均購自大連寶生物公司；植物激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）、水楊酸、茉莉酸、聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG6000）、氯化鈉（Sodium chloride）、氨芐霉素（Ampicillin）購于北京鼎國生物公司。

1.2 方法

1.2.1 水稻幼苗的種植及處理 取日本晴水稻種子若干置于小燒杯中，用75%的酒精消毒30 s，再用無菌水沖洗5-6次，每次沖洗1 min。用無菌水完全淹沒種子，浸泡1 h。將種子轉移至培養皿中，加入適量的水（不能完全淹沒種子），28℃黑暗培養2-3 d。待種子長出幼芽后，采用人工氣候箱進行培養，培養條件為28℃、光照強度16 000 lx、光照時間為16 h/d。將水培生長15 d的水稻幼苗轉移到培養皿中。待水稻幼苗適應2 d后，分別用含有150 mmol/L NaCl（鹽脅迫）、30% PEG6000（模擬干旱脅迫）、100 μmol/L JA、100 μmol/L SA 和 100 μmol/L ABA的Yoshida培養液［19］處理水稻幼苗，處理方法參照張靜等［20］方法進行。分別在處理0、3、6、9、12和24 h后取水稻幼苗的根組織適量，經液氮速凍后，保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2.2 水稻的大田種植及取材 試驗田平整、浸泡作為苗床育苗，2014年5月1日將種子分散播種至苗床，加水淹沒苗床，2014年5月25日進行分苗，在水稻生長至幼穗期取其根、莖、葉、葉鞘、幼穗（生長至1-2 cm、3-5 cm、5-8 cm）組織，液氮速凍后保存于-80℃冰箱。

1.2.3 總RNA的提取和cDNA的合成 采用TRizon法提取上述組織的總RNA，經快速電泳，檢測確認后，按照反轉錄試劑盒說明書，配制反轉錄反應體系，制備cDNA。

1.2.4 水稻OsMPK15的cDNA編碼區的克隆 以上述制備的水稻根組織的cDNA為模板，用根據水稻OsMPK15編碼框設計引物P1/P2，擴增OsMPK15的cDNA編碼區。PCR反應體系為cDNA 1 μL、上下游引物各 0.5 μL、dNTP 2.5 μL、5×Taq buffer 5 μL、Taq酶 0.5 μL，加 ddH2O 至終體積 50 μL；反應程序為 95℃ 2 min ；95℃ 20 s，53℃ 20 s，72℃ 1 min，40個循環；72℃ 5 min；4℃保存。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，采用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶。取3 μL回收產物與pEASY-T載體（含T4連接酶）連接后轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，將轉化產物涂布于含有100 μg/mL Ampicillin的LB固體培養基上，于37℃恒溫培養箱倒置過夜培養。挑取LB固體培養基的單克隆，接種至5 mL含有100 μg/mL Ampicillin的LB液體培養基中，37℃，200 r/min，震蕩培養過夜，雙酶切鑒定后測序。將測序獲得的OsMPK15的cDNA編碼區提交至 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行序列分析和同源檢索。采用DNAMAN軟件進行序列比對，繪制系統發育樹。引物（表1）均委托蘇州金唯智生物公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.5 水稻OsMPK15不同組織中的表達分析 以組成型表達的OsActin1為內參基因進行實時定量熒光PCR檢測，以反轉錄制備的各個組織樣品的cDNA為模板，采用P3/P4和P5/P6引物組合分別擴增OsMPK15和OsActin1。熒光定量反應體系為SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，上下游引物（10 μmol/L） 各 0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，cDNA 2 μL，加 ddH2O 至終體系 20 μL。使用ABI 7500 實時PCR儀（Applied Biosystems）進行PCR擴增。反應采用兩步法PCR擴增標準程序95℃30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s，40個循環。每個組織進行3次重復，采用2-△△Ct法分析結果，數據統計采用Excel軟件，顯著性分析采用Spass v19.0軟件。

1.2.6 OsMPK15對非生物脅迫和激素的響應分析取經過干旱、高鹽、激素處理的水稻幼苗根組織，以組成型表達的OsActin1為內參基因，進行OsMPK15的qRT-PCR分析，操作同1.2.5。

2 結果

2.1 水稻OsMPK15的cDNA編碼區的克隆

以提取的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，P1/P2為引物，擴增得到1條約1 500 bp的特異性片段，與預期的OsMPK15序列的cDNA編碼區序列大小符合（圖1-A）。將上述PCR產物進行膠回收，與pEASY-T載體連接。將連接產物轉化大腸桿菌，篩選轉化子。挑取若干單菌落分別擴大培養，提取質粒進行雙酶切鑒定（圖1-B）。將篩選到的陽性克隆進行測序，測序結果顯示，通過RT-PCR技術克隆的OsMPK15序列與文獻推測的序列［21］一致，OsMPK15的cDNA編碼區長1 497 bp，預期編碼498個氨基酸和1個終止密碼子。

圖1 OsMPK15的cDNA編碼區的擴增和克隆

2.2 水稻OsMPK15的序列分析

將OsMPK15的cDNA編碼區序列提交至NCBI，分析其編碼蛋白的保守結構域，發現該蛋白在第13-304處的氨基酸對應MAPK特有的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域。利用DNAMAN軟件，對水稻MAPK家族E組的3個成員OsMPK13、OsMPK14和OsMPK15進行比對（圖2），發現盡管構成3種蛋白的氨基酸數目不同，但是序列同源性很高，尤其是N端序列相似性很高，其序列差異主要體現在C端；且絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域具有高度保守性，都具有TDY基序。其中OsMPK14和OsMPK15蛋白同源性達到82.87%。

將OsMPK15蛋白質序列提交至NCBI進行BLAST檢索，選擇其中11種同源性較高的，來自花生、番茄、葡萄、卷柏、小麥、擬南芥、煙草、棉花及苜蓿的MAPK，采用DNAMAN軟件進行多序列比對分析，結果（圖3）顯示，與水稻OsMPK15相似性最高的是小麥TaMPK2，同源性高達79.78%，提示二者可能是同源基因。

圖2 水稻MAPK家族E組3個成員的氨基酸序列比對

圖3 基于水稻OsMPK15與其他植物MAPK序列構建的系統發育樹

2.3 OsMPK15在幼穗期水稻中的表達特性

以組成型表達的OsActin1為內參基因，通過熒光定量PCR檢測OsMPK15在幼穗期水稻根、莖、葉、葉鞘以及不同發育階段幼穗組織中的相對表達水平。結果（圖4）顯示，OsMPK15在水稻幼穗期所檢測的各組織中普遍表達，但表達水平存在差異。其中在葉和葉鞘中的表達量顯著高于在其他組織中的表達量，是其他組織中表達量的4-6倍。

2.4 激素對OsMPK15在幼苗根中表達的影響

以JA、SA和ABA分別處理15 d的水稻幼苗，以水稻OsActin1作為內參基因，采用qRT-PCR技術檢測OsMPK15在3種激素處理后的根中24 h之內的表達變化。結果（圖5）顯示，OsMPK15對3種激素均有應答，在檢測的24 h內，均出現表達水平上調，而后恢復的趨勢，但是表達峰值出現的時間不同，其中JA處理12 h后其表達上調了4倍，SA處理3 h后表達上調了4倍，ABA處理9 h后其表達上調了7倍，提示該基因對這些激素的敏感度和應答模式存在差異。

圖4 OsMPK15在水稻幼穗期各組織中的表達

2.5 非生物脅迫對OsMPK15基因表達的影響

對水稻幼苗進行模擬干旱和高鹽處理，采用實時熒光PCR檢測該基因在根中24 h之內的表達變化，發現在模擬干旱的脅迫下，OsMPK15的表達量出現明顯上調，在處理的12 h內其表達量維持在0 h的3倍左右，隨后呈現下降趨勢；在高鹽處理條件下，其表達量也有上調，在9 h內表達量逐漸上升，達到2倍后呈現下降趨勢（圖6）。結果表明，干旱和高鹽對OsMPK15的表達都有影響，但是相比之下，干旱對該基因表達的影響更為顯著。

圖5 JA、SA和ABA激素處理對OsMPK15基因表達的影響

圖6 干旱和鹽脅迫對OsMPK15表達的影響

3 討論

無論酵母還是動植物的MAPK在進化過程中都高度保守，具有相似的保守結構。與動物的細胞外調節蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）相似，植物MAPK活性環上同樣具有TDY或TEY基序［21］。同樣，依據活性環上特殊基序TXY的種類（TEY/TDY），將水稻MAPK劃分為A-F 7組，本研究通過RT-PCR技術克隆的OsMPK15序列與文獻推測的序列［22］一致，預期編碼的蛋白包含498個氨基酸，屬于E組成員。與之同屬E組的OsMPK13已被證實參與苯并噻二唑（Benzothiadiazole，BTH）誘導的水稻抗病反應［23］，OsMPK14在水稻的非生物脅迫與激素應答調控過程中具有重要作用［22］，但對OsMPK15的研究尚未見報道。

不良的土壤條件如干旱、高鹽等是制約水稻產量的主要因素。已有研究顯示，MAPK在植物應答多種非生物脅迫的過程中扮演了重要的角色。例如，在擬南芥中，低溫、高鹽、機械損傷等可以顯著提高AtMEKK1的轉錄水平［24］；低溫、干旱、高滲、創傷等可以激活AtMPK4和AtMPK6的瞬時表達［25］。水 稻 中 OsMPK4、OsMPK5、OsMPK7、OsMPK8和OsMPK12等都可以被干旱、鹽或者溫度的變化而誘導表達［26-28］。為了研究非生物脅迫對水稻OsMPK15基因表達的影響，本研究模擬了干旱和高鹽脅迫，并利用實時熒光定量PCR技術進行了檢測。發現在干旱和鹽脅迫下，OsMPK15在根中的表達量均出現上調。相對于鹽脅迫，OsMPK15對干旱脅迫更敏感。有報道顯示，與OsMPK15同源性極高的OsMPK14和小麥TaMPK2均參與了非生物脅迫和激素的應答調控過程［22］。已有研究顯示，外源ABA影響了多種植物MAPK基因的表達、蛋白的積累以及酶的活性，MAPK還參與了ABA介導的多種信號通路，包括氧化防御、保衛細胞信號轉導和種子的萌發［29-32］。在擬南芥中，JA和SA可以誘導AtMPK6和AtMPK3的表達［33-34］。本研究發現，OsMPK15對激素ABA、JA和SA均有響應，其中以ABA誘導OsMPK15表達上調幅度最大。鑒于ABA是植物逆境脅迫相關激素，OsMPK15對ABA處理產生高度的應答反應，同樣暗示該基因可能參與了水稻的逆境脅迫應答過程。本研究還發現，OsMPK15的表達與實驗室前期報道的OsMPK14基因的表達模式十分相似，但也存在顯著差異，如OsMPK14的表達在一定程度上受到干旱脅迫的抑制作用［18］，這些結果說明這兩種水稻MAPK與水稻的非生物脅迫應答有密切聯系。此外，OsMPK15在幼穗期的水稻各組織中在葉和葉鞘中優勢表達，OsMPK14在水稻地上部分的表達受到光的負調控［18］，提示它們也可能與水稻的光信號通路存在關聯，值得進一步的深入研究。

本研究結果提示，水稻OsMPK15可能與水稻的非生物脅迫應答、激素信號通路以及光信號通路有所關聯，但其具體功能尚未見報道，應答機制也有待研究。目前，實驗室已通過CRISPR-Cas9基因組編輯技術構建了OsMPK15敲除水稻，后續將開展對OsMPK15與水稻非生物脅迫應答、激素應答、光信號通路關系的研究，以期對其功能開展進一步的分析鑒定，為揭示其在體內的作用機制提供理論依據。

4 結論

克隆了水稻OsMPK15的cDNA編碼區，發現該基因在不同組織中表達存在差異，能夠被ABA、SA、JA高度誘導，同時受干旱和鹽脅迫影響，推測該基因可能與水稻的抗逆應答過程密切相關。

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