啟動子的選擇及優化在釀酒酵母代謝工程中的應用

王珂雯 尹雪 王宇 李玉花

（東北林業大學生命科學學院，哈爾濱 150040）

天然產物作為生物體內自身代謝合成的一種微量次生代謝物，因其具有高效的藥理活性，被人們廣泛應用于醫療保健和食品等領域。近年來利用微生物進行基因工程操作，實現天然產物的大量合成已成為目前的研究熱點，如利用大腸桿菌（Esherichia coli）或酵母合成可以預防心腦血管疾病的白藜蘆醇、具有止痛功效的嗎啡以及具備抗癌功效的人參皂苷和紫杉醇等藥物［1-3］；在鏈霉菌（Streptomyces）中實現了深海極端環境微生物中具有化學防御、信號傳導的特殊代謝產物的異源合成［4］。釀酒酵母作為已完成全基因組測序的真核模式生物，與其他真核生物如煙草細胞相比，它在代謝工程研究中具有生物繁殖速度快、生長周期短、易于培養、不易污染等特點［5］；而與原核生物如大腸桿菌相比，不僅可以高密度發酵，還具有其他優點：含有線粒體、內質網等細胞器，利于表達有生物活性的異源蛋白，特別是適合植物細胞色素P450類蛋白的表達［6］；DNA重組效率高，能夠一次性插入多個大片段的外源基因，并且能夠穩定遺傳。同時，最近釀酒酵母人工染色體從頭合成的成功實現為未來發揮酵母巨大潛力提供可能［7］。目前研究人員利用釀酒酵母表達系統已經成功合成了生物堿、萜類、不飽和脂肪酸及其他一些重要的化合物（表1）。

表1 利用釀酒酵母生產的重要化合物

目前對代謝工程的改造主要集中在通過導入特定的催化酶、調節蛋白來構建新的代謝通路，或者優化釀酒酵母自身的代謝途徑，而選擇合適的基因啟動子可以對能量和營養物質在終產物代謝途徑和細胞自身代謝途徑之間的供給交換進行精細和定量地調控，實現目標基因表達強度的最佳組合。因此，在釀酒酵母工程菌中選擇合適的啟動子顯得尤為重要。啟動子作為轉錄調控的重要元件，其活性的強弱可以顯著影響異源基因轉錄的起始、持續時間和表達的程度，進而影響外源基因在宿主中的轉錄效率，同時也決定了細胞中mRNA的總體豐度和蛋白質含量，最終高效地合成目標產物。本文將基于如何選擇和修飾釀酒酵母啟動子用來高效合成目標產物，分別對釀酒酵母啟動子結構、類型和優化策略幾個部分進行了詳細介紹。

1 釀酒酵母啟動子結構

啟動子位于結構基因5′端的上游區域，直接調控基因時空特異性表達。真核生物啟動子由核心啟動子（Core promoter）和上游啟動子元件（Upstream promoter element）組成（圖 1）。

1.1 核心啟動子

核心啟動子由TATA盒（TATA box）、TFⅡB識別元件（Transcription factor for RNA polymerase IIB recognition element，BRE）、 起 始 子（Initiator，Inr）和下游啟動子元件（Downstream promoter element，DPE）4個元件構成，它們位于轉錄起始位點的上游40 bp到下游40 bp之間（圖1）。但在釀酒酵母中，大部分元件都已退化［21］，僅有20%的釀酒酵母基因啟動子還存在著TATA盒，共同序列為TATA（A/T）A（A/T）（A/G）［22］。并且釀酒酵母啟動子的 TATA盒位置具有可變性，一般位于轉錄起始位點上游的40-120 bp 處［23］。

1.2 上游啟動子元件

釀酒酵母核心啟動子TATA盒上游存在一段保守的調控區被稱為上游啟動子原件，可分為上游激活序列（Upstream activation sequences，UAS）和上游抑制序列（Upstream repression sequences，URS）［24］。轉錄激活因子和轉錄抑制因子可以分別與其特異性結合，從而促進或抑制RNA聚合酶的結合效率調節下游基因的轉錄。上游激活序列最先在酵母中被發現，如半乳糖代謝酶基因Gal的上游激活序列由4個相連的17 bp序列組成；精氨酸酶基因Car1的上游激活序列為一段13 bp的序列［25］。上游激活序列的作用類似于增強子，但與增強子不同的是，上游激活序列一般位于轉錄起始位點上游的100-500 bp之間，距離過遠就會失去促進轉錄的活性［26］。

圖1 啟動子結構示意圖

2 釀酒酵母啟動子類型

在釀酒酵母工程菌的實際應用中，常用的天然啟動子來源于釀酒酵母宿主本身和外源宿主。釀酒酵母宿主內源啟動子根據其作用方式或功能可分為組成型啟動子、誘導型啟動子和雙向啟動子，而來源于外源宿主的啟動子被稱為異源啟動子。選擇合適類型的啟動子不僅可以控制目標基因的表達，還可以對基因的表達量進行精細調節。

2.1 組成型啟動子

組成型啟動子又稱非特異性啟動子，在其調控下，同一基因在不同生長環境及生長階段的表達無明顯差異，且始終維持在一個相對穩定的水平。

基因表達量與組成型啟動子的強弱密切相關，因此組成型啟動子相對強度的大小在實際應用中尤為重要。當需要提高基因的表達量時，選擇強啟動子，反之則選弱啟動子（表2），目前組成型啟動子的相對強度可以采用多種報告系統來進行評估。Partow等［27-28］通過檢測LacZ的活性，比較了7種組成型啟動子的強度，獲得的相對強度大小為：pTEF1≈pPGK1≈pTDH3＞ pTPI1≈pPYK1 ＞ pADH1 ＞pHXT7。Sun等［29］從釀酒酵母中克隆了14種組成型啟動子并通過GFP的發光強度和mRNA水平來檢測啟動子的相對強度，其中pTEF1強度相對最高，pPGI1的強度相對最低。Blount等［31］利用流式細胞儀檢測了GFP的發光強度，從而確定pPFY1、pADH1、pCYC1、pBIO2、pCHO1中 pADH1的 強 度相對最高，pCHO1的強度相對最低。Monfort等［31-32］通過表達脂肪酶來比較釀酒酵母中的pACT1、pADH1、pPGK1及pTDH1的相對強度，最終發現pACT1的強度相對最高。

組成型啟動子雖然能夠持續高強度表達目的蛋白，但基因過量表達會造成代謝紊亂，同時會引起重組蛋白在生長過程中降解［33］，并且組成型啟動子不適用于毒蛋白的表達。

2.2 誘導型啟動子

誘導型啟動子在某些特定的物理及化學信號的誘導刺激下，可以大幅度地提高或降低基因的轉錄水平，因此可以通過人為添加誘導劑定時定量地對目標基因表達程度進行調控。誘導型啟動子又可以按照功能分為激活型啟動子和阻遏型啟動子（表3）。

2.2.1 激活型啟動子 激活型啟動子即正調控啟動子，一般是通過招募轉錄激活因子或釋放轉錄抑制因子來實現轉錄調節的。其優點是只有當誘導物存在時，基因才可以正常表達，沒有誘導物存在時基因表達水平很低甚至沒有。

激活型啟動子常用的誘導劑有碳源（半乳糖、葡萄糖）、銅離子、生物素及α1調節蛋白。目前在釀酒酵母中應用最多的激活型啟動子是來源于降解半乳糖代謝途徑的半乳糖誘導啟動子（pGAL1、pGAL7、pGAL10）。當培養基中的碳源為半乳糖時，轉錄誘導因子Gal3p與半乳糖結合后，會與抑制因子Gal80p相互作用，轉錄激活因子Gal4p發揮活性，從而激活目標基因的表達［34-35］。目前利用該啟動子系統已經成功在釀酒酵母中合成了青蒿酸［36］、人參皂苷［37］等物質。

2.2.2 阻遏型啟動子 酵母啟動子阻遏系統建立在阻遏蛋白與轉錄因子在空間構型相互作用的基礎之上。當誘導物存在時，其會與激活蛋白結合，阻遏蛋白則與啟動子上的元件結合，抑制基因的轉錄。

阻遏型啟動子常用的抑制劑有碳源（葡萄糖）、磷酸鹽、鐵離子、蛋氨酸、滲透壓及氧氣。釀酒酵母adh2基因編碼乙醇脫氫酶II，其轉錄起始于葡萄糖耗盡，乙醇作為碳源發酵的同時，轉錄激活因子乙醇脫氫酶調節蛋白Adr1可大量表達并起始ADH2的轉錄［38］。目前已經有研究團隊利用該啟動子表達外源蛋白，在釀酒酵母工程菌中合成了聚酮化合物［39］、三醋酸內酯［40］等物質。

應用誘導系統可以將細胞的生長階段與目標蛋白的生產階段分開，避免了外源蛋白早期表達對自身細胞的傷害。但該類型啟動子存在著操作繁瑣，誘導劑價格昂貴，添加的誘導劑可能會對細胞本身的生長產生負面影響等諸多在實際生產中難以解決的問題。

表2 釀酒酵母中常用的組成型啟動子

2.3 雙向啟動子

雙向啟動子普遍存在于釀酒酵母的基因組中，它能以兩個相反的方向啟動轉錄。目前釀酒酵母中應用最多的雙向啟動子載體是pESC載體，通過pGAL1-pGAL10可以在同一時間轉錄兩個不同的基因，這兩個啟動子的轉錄起始位點相距約600 bp。該系列的載體已用于人參皂苷CK的合成［37］。

2.4 異源啟動子

在實際應用中，使用酵母內源啟動子可能會干擾酵母的自身代謝反應，降低酵母的生長活性，因此可以采用外源啟動子來構建代謝途徑。其中常用的異源啟動子可以來源于病毒、細菌和真菌等外源宿主。目前，在釀酒酵母中常用巨細胞病毒的啟動子pCMV組成型表達外源基因，它的活性受亞砷酸鹽的調控［52］。細菌中的tet操縱子，會被培養基中的四環素類似物多西霉素所抑制，而多西霉素并不會影響酵母的生長狀態和內源基因的mRNA轉錄水平［53］。應用棉病囊霉（Ashbya gossypii）的 pTEF1進行特定位點的同源重組時，酵母內源的pTEF1并不會影響外源基因的重組效率，同時又避免了在同源重組過程中因序列相似度高而產生錯誤插入［54］。

表3 釀酒酵母中常用的誘導型啟動子

3 釀酒酵母啟動子優化

根據上文所述，在代謝工程中應用自身和異源啟動子的方法已經獲得了廣泛的應用，但隨著功能基因組學和代謝組學的快速發展，科學家們通過對現有的啟動子進行突變、融合的優化方式來獲得不同功能、不同強度的啟動子，以期在進一步提高轉錄能力的同時還可以對宿主代謝進行更為精細的人工調控。以下將介紹釀酒酵母啟動子工程的具體策略及相關的應用實例。

3.1 天然啟動子突變優化

在明確天然啟動子活性的情況下，可以通過突變轉錄因子結合位點來改變轉錄因子的結合能力，直接達到改變其啟動強度的目的。根據作用方式的不同，可以將突變優化分為隨機突變優化（易錯PCR、飽和誘變）和定向突變優化（直接修飾）。

易錯PCR（Error-prone PCR）適用于整個啟動子區域，通過隨機突變可產生具有不同的強度和功能的啟動子。Redden和Nevoigt等［55-56］使用易錯PCR將pTEF1隨機突變并篩選出活性范圍是天然pTEF1活性 8%-120%的11個突變體，最終發現兩個活性中等的啟動子可以降低副產物甘油的產量，該研究使酒精、甘油產量及細胞生長三者之間達到一個相對平衡的狀態。此外，也有人將pDAN1隨機突變并得到兩個對氧氣含量不敏感的突變體，使下游基因的表達量顯著增加，大大提升了終產物的合成量［57］。2015年，張旭等［58］利用易錯PCR 篩選得到的具有高表達性能的pTEFV1，使GFP和人血清白蛋白的表達能力較改造前有明顯增加。

飽和誘變（Saturation mutagenesis）是指對基因的某一特定局部小區域內的堿基進行所有類型的突變。該技術最早應用于細菌啟動子系統，有效地改變了單基因或多基因操縱子的表達水平［59］。Jeppsson團隊參考天然啟動子相關結構設計了一個名為YRP的啟動子［60-61］，降低了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性，進而增加乙醇的產量。對pPFY1的非必需區域進行飽和誘變可篩選得到36個有不同活性的非天然啟動子。近年來也有人對pSUL1中的493 bp序列進行誘變及篩選，發現突變后的結構可以提高轉錄效率［62］。

事實上，對啟動子強度的調控是基于核苷酸序列響應轉錄機制的累積效應。直接對目標啟動子的上游元件進行增加或刪除修飾就可以得到活性不同的啟動子。將pGAL1上游激活元件UASGAl串聯加倍得到的突變啟動子UASGal-pGAL1在半乳糖誘導下其活性略高于pGAL1［64］。對pADH1的5′端調控區域進行不同程度的刪減可以顯著改變啟動子對葡萄糖的應答，從而改變基因的表達強度［64-67］。此外，通過直接優化轉錄因子也可以達到增強啟動子活性的目的。釀酒酵母pARO9在添加外源色氨酸的情況下可以組成型表達，而蛋白質工程優化后的轉錄因子Aro80p可增強與該啟動子的結合效率，從而增強該啟動子的活性［68-69］?；趐GAL的作用機制，敲除抑制因子Gal80后的啟動子在葡萄糖中具有組成型表達的活性［70］。

3.2 人工啟動子雜合優化

雜合啟動子就是將兩種或兩種以上不同來源的啟動子元件融合構成的一個新的啟動子。雜合啟動子的高強度和穩定性對于精細調控細胞中的基因表達具有極其重要的意義。

釀酒酵母中的雜合啟動子大多是將自身不同的啟動子核心區域與調節區域融合進而增強雜合啟動子的活性。將不同比例或組合型的轉錄激活元件分別與pTDH3融合后，發現串聯3倍的UASCLB啟動子可使轉錄活性提高2.5倍。因此，利用該方法可以將弱啟動子定向轉變為強啟動子。此外，與天然啟動子相比雜合啟動子的活性更加穩定，將3個串聯的激活元件UASCLB與pTEF1的核心區域所組裝而成的人工雜合paTEF1在不同宿主的不同生長階段其活性均高于天然pTEF1［71］。

釀酒酵母雜合啟動子的構建也可以采用將不同來源的啟動子核心區域與調節區域融合的方式。其中，在釀酒酵母中應用最多的異源啟動子為細菌的四環素操縱子。1997年，Gari等［72］構建了一系列由tetO-CYC1雜合啟動子驅動的表達載體，在缺乏抑制劑多西霉素的環境下，基因的表達活性可以提高1 000倍，該啟動子可應用于P-蛋白和羊毛甾醇脫甲基酶的表達［73-74］。而后Belli團隊構建了一個釀酒酵母四環素操縱子誘導基因表達的雙系統，將反式激活因子中的tetR進行突變優化并命名為tetR’，通過外源施加的四環素可快速激活下游基因表達［75-76］。

另外，也有利用雜合轉錄因子調節目標基因表達的可調控系統。例如，Shimizu-Sato等［77］通過表達兩種嵌合蛋白光敏色素的Gal4-DNA結合域和PIF3-Gal4激活域，進而實現光信號調控下的基因表達調控目標，構建了一個可精確定量的誘導表達系統，有利于工業生產的大規模應用。也有應用人類激素來調控啟動子的活性，構建含有β-雌二醇受體、Gal4結合域，以及皰疹病毒蛋白的轉錄激活結構域的雜合轉錄激活因子，通過添加β-雌二醇可以顯著提高下游基因的表達水平［78］。2016 年，Hector等［79］利用芽孢桿菌中的DNA結合阻遏因子（XylR）與pTEF形成的新型雜合啟動子，使pTEF的表達強度在木糖培養條件下增加25倍。

釀酒酵母啟動子的優化在代謝工程精細調節方面擁有巨大的潛能，為了突出比較上述4種啟動子優化策略的特點，現將其優缺點總結如下（表4）。

表4 釀酒酵母啟動子優化類型的優缺點

4 總結和展望

釀酒酵母是一種食品級、基因組結構最為簡單的真核微生物，具備安全、遺傳操作便捷、培養簡單和繁殖迅速等優勢，是生產重組蛋白較理想的表達系統之一。啟動子是代謝工程中最基本的功能元件，是最有效的調節代謝途徑的工具。通過改造釀酒酵母啟動子從而改變其自身的代謝途徑來高效地獲取目標天然產物已成為一種極具前景的策略。本文梳理了當前利用釀酒酵母合成天然產物過程中的啟動子結構和在釀酒酵母工程菌中使用的4類天然啟動子，總結概括了每一類別的特點。此外，為了提高釀酒酵母啟動子活性達到能夠更加高效的合成目標天然產物的目的，歸納了釀酒酵母啟動子突變和雜合的兩種優化策略，以及該技術在實際生產中的一些應用。

近年來，隨著合成生物學的發展和技術手段的更新，越來越多的研究人員在探索原核啟動子模型中做出了巨大貢獻，如通過在原核啟動子上采用“絕緣化”和“非門”（NOT gate）功能基因網絡預測的方法，表明該方法可以顯著提高它們的模塊化屬性和組裝過程的可預測性［84］。此外，Rohlhill等［85］采用熒光激活細胞分類術（FACS）和高通量篩選對大腸桿菌甲醛誘導啟動子進行精確地定量分析，確定了單核苷酸分辨率，從而更高效的協調基因表達，并在合成生物學和代謝工程中建立了可預測的基因電路?；诋斍暗难芯?，越來越多的研究者也會對真核啟動子進行深入探索，有望提高啟動子控制基因的表達效率。

未來，通過啟動子工程技術，釀酒酵母啟動子將朝著以下幾個方向進行改進：（1）研發基因表達量可控的組成型啟動子；（2）研發培養條件溫和、操作簡單、誘導劑成本低廉的誘導型啟動子；（3）具有高效轉錄效率的異源啟動子并在發酵培養過程中得到有效控制；（4）研發能夠更加高效、穩定、可控、成本低廉、可工業化的釀酒酵母啟動子將是未來啟動子工程技術突破的關鍵。這些研究成果的推廣與應用，將有力地推進人工構建生命系統的研究進程，從而滿足人們在健康、醫療、環境、食品等領域的高層次需求。

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