小檗堿增強絲裂霉素C誘導的膀胱癌T24細胞周期阻滯及凋亡*

秦曉平，詹雄宇，陳奇彪，黃保元，黃 君，卓育敏△

(暨南大學附屬第一醫院 1泌尿外科， 2超聲科， 廣東 廣州 510632)

膀胱癌在發達工業國家是最常見的泌尿外科惡性腫瘤之一,其在臨床上主要分為兩大類型，一是非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)；二是肌層浸潤性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer, MIBC)，其中NMIBC發病率占所有膀胱癌的70%～80%[1]。經尿道膀胱腫瘤電切術(transurethral resection of bladder tumor, TURBT)和術后輔助性膀胱灌注治療[2-3]是治療 NMIBC的標準療法。臨床研究顯示膀胱灌注絲裂霉素C (mitomycin C, MMC；又稱自力霉素)，可以有效地預防低危淺表性膀胱癌的復發[4]。國內也有相關研究報道[5]，應用絲裂霉素灌注膀胱治療58例淺表性膀胱癌患者并取得較好的療效。雖然MMC作為一種擁有確切治療效果的膀胱灌注化療藥物，并已廣泛應用到臨床各類型腫瘤的術后輔助化療中，但是它的不良反應仍限制了它在治療膀胱癌中的應用。所以，尋找一種對治療膀胱癌具有更高療效，又能通過降低MMC灌注劑量從而減少對正常細胞損傷的治療方法，具有十分重要的臨床意義。

小檗堿(berberine，Ber)作為一種天然的異喹啉類生物堿，是從黃連屬草本植物中分離的，具有多種藥理及生物學活性，包括抗腫瘤，降血脂，抗微生物和抗炎等[6-9]，其抗腫瘤作用已成為近年來研究的熱點。大量的研究表明，小檗堿對骨髓、肝、肺、胃腸道、膀胱和前列腺等類型腫瘤細胞的生長具有抑制作用[6-8]。研究發現，小檗堿的抗腫瘤的特性與其抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，引起細胞周期阻滯和細胞遷移的抑制有關[10-11]。此外，有研究發現，Ber (1 μmol/L)能增強表阿霉素和阿霉素誘導膀胱癌T24細胞的細胞凋亡和細胞周期阻滯，從而增強其對膀胱癌細胞的抗增殖作用，其機制可能與內源性凋亡信號通路激活有關[12-14]。然而小檗堿聯合絲裂霉素對膀胱癌細胞是否有影響？目前尚缺乏深入研究。因此，本文觀察小檗堿聯合絲裂霉素C對膀胱癌細胞T24的細胞周期及凋亡的影響，并探討潛在的作用機制。對尋找一種對治療膀胱癌有更高療效，又能減少其副作用的治療方法，具有十分重要的臨床意義。

材 料 和 方 法

1 主要材料

人類膀胱癌T24細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院(目錄編號：TCHu55)。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、RPMI-1640培養基、0.25%胰酶和雙抗(青霉素和鏈霉素)均購自HyClone；細胞增殖活性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購自Dojindo；中性硫酸小檗堿購自Sigma；注射用絲裂霉素(每支2 mg)購自浙江海正藥業股份有限公司；本研究中所使用的所有抗體均購自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1T24細胞培養 細胞采用含10% FBS和10% 雙抗的RPMI-1640培養基培養，于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中進行培養。將T24細胞分為4組：對照(control)組、MMC組、MMC聯合Ber(MMC+Ber)組和Ber組。

2.2CCK-8法檢測T24細胞活力 以每孔2×104個細胞接種于96孔細胞培養板中，24 h后取出細胞培養板觀察細胞的生長情況。分別加入不同劑量的小檗堿(0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和2.0 μmol/L)和/或絲裂霉素(150 μmol/L)，設置空白對照(control,Ctrl)組。分別培養24 h和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8檢測試劑，置于培養箱匯總繼續培養30 min。隨后用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度(A)，以上實驗重復3次。細胞活力(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。

2.3流式細胞術檢測各組細胞周期分布 將T24細胞以每孔1×106個細胞接種于6孔細胞培養板中培養24 h,后按分組對其進行加藥，24 h后收集細胞，1 500 r/min離心5 min，再用PBS洗滌細胞1次。每管500 μL 70%乙醇重懸細胞，放置-20 ℃ 固定過夜。第2天染色前，用PBS洗去乙醇，1 500 r/min離心5 min，加入5 μL RNase A，37 ℃ 水浴30 min，再加入10 μL PI染色液，充分混勻后于室溫下避光孵育15 min后即可用流式細胞儀檢測。

2.4Western blot 檢測蛋白表達 將T24細胞以每孔1×106個細胞接種于6孔板細胞培養板中培養24 h后對其進行加藥，24 h后獲得細胞沉淀。用預冷的PBS洗滌細胞2次，每孔加入150 μL含PMSF的RIPA裂解液，吹打混勻后置于冰上裂解30 min，每隔10 min 用細胞刮刀刮1次細胞，讓RIPA裂解液與細胞充分混勻，收集上述混合液于EP管中，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，吸取上清，BCA蛋白定量測定試劑盒(碧云天)進行蛋白定量。以12% SDS-PAGE分離，半干轉法轉移至PVDF膜，轉膜結束后取出PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。根據marker位置切取目的條帶，分別加入相應的Ⅰ抗于4 ℃孵育過夜。第2天，加入相應的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h。在膜上滴加ECL發光液，X線底片曝光，GAPDH作為內參照。上述實驗重復3次。

2.5Annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞術檢測細胞凋亡 每孔以1×106個細胞接種于6孔細胞培養板中，培養24 h后對其進行加藥處理，24 h后收集細胞，包括漂浮在培養基上的細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL Binding Buffer，重懸混勻后，加入5 μL Annexin V-FITC，室溫下避光孵育10 min染色，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL Binding Buffer 充分重懸混勻后，加入5 μL PI染色，上機檢測各組細胞的凋亡率。上述實驗重復3次。

3 統計學處理

所有數據采用SPSS 13.0 軟件進行統計學分析。計量資料用均數±標準誤(mean±SEM)表示，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間均數兩兩比較采用Bonferroni法檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 CCK-8法檢測T24細胞活力

不同濃度(0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和2.0 μmol/L)的Ber協同MMC(150 μmol/L) 分別處理T24細胞24 h和48 h后，用CCK-8法檢測細胞活力，結果提示,處理48 h后，MMC+Ber組較MMC組對T24細胞活力的抑制效果更明顯(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The viability of T24 cells treated with MMC and Ber for 24 h and 48 h. Mean±SEM.n=3;*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMMC group.

圖1Ber聯合MMC對T24細胞活力的影響

2 流式細胞儀檢測T24細胞周期結果

如圖2所示，加藥處理T24細胞24 h后，MMC+Ber組較MMC組有更多細胞阻滯在G0/G1期，并且T24細胞在S期細胞數量明顯減少(P<0.05),見圖2。

Figure 2. Effects of MMC and Ber on cell cycle in T24 cells. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol (Ctrl) group;#P<0.05vsMMC group.

圖2Ber聯合MMC對T24細胞周期的影響

3 Ber對MMC處理后的T24細胞p21、p27、CDK2、CDK4、cyclin D1和survivin蛋白表達的影響

Western blot實驗結果顯示，與MMC組相比，MMC+Ber組能上調p21和p27蛋白的表達(P<0.05)，并且能下調cyclinD1、CDK2、CDK4以及survivin蛋白的表達(P<0.05)，見圖 3、4。

Figure 3. Effects of Ber on p21 and p27 protein levels in MMC-treated T24 cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol (Ctrl) group;#P<0.05vsMMC group.

圖3Ber對MMC誘導的T24細胞p21和p27蛋白表達的影響

Figure 4. Effects of Ber on the protein expression of CDK2, CDK4, cyclin D1 and survivin in T24 cells treated with MMC for 24 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol (Ctrl) group;#P<0.05vsMMC group.

圖4Ber對MMC誘導的T24細胞cyclinD1、CDK2、CDK4和survivin蛋白表達的影響

4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測結果

Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡的結果顯示,MMC+Ber 組細胞凋亡率明顯高于MMC組(P<0.05)，以上結果表明Ber能促進MMC誘導T24細胞凋亡,見圖5。

討 論

TURBT是目前治療NMIBC的標準治療方法， 然而術后仍有較高的腫瘤復發率，所以，術后行膀胱輔助灌注化療或者免疫治療已成為預防腫瘤復發和進展的重要手段之一。目前臨床上膀胱灌注化療及免疫治療藥物的種類較多，常用的有蒽環類藥物[15-17]。MMC是臨床上較為常用的膀胱癌術后化療藥物之一。近年來，術后灌注MMC對控制腫瘤復發得到了證實。但長期高劑量的使用會導致患者出現血尿、尿頻和尿急等刺激癥狀從而導致膀胱儲尿時間變短，甚至會影響藥物治療的時間，影響治療效果。同時蒽環類藥物的心臟毒副作用亦限制了其在臨床上的應用。同時Lv等[18]報道小檗堿能抑制阿霉素引起的心肌細胞凋亡。Li等[19]研究發現小檗堿能通過抑制ROS的產生，抑制H2O2誘導的大鼠骨髓間充質干細胞細胞凋亡。綜上所述，小檗堿一方面能抑制腫瘤細胞生長，另一方面它能保護正常體細胞。如果將Ber和MMC聯合用藥能否起到增強對膀胱癌的療效，同時又減輕絲裂霉素的毒副作用？目前尚缺乏相關研究。

Figure 5. The effects of Ber on the apoptosis of MMC-induced T24 cells detected by flow cytometry. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol (Ctrl) group;#P<0.05vsMMC group.

圖5流式細胞術檢測Ber聯合MMC誘導T24細胞凋亡率

本課題組前期用CCK-8法檢測藥物處理后的T24 細胞，結果表明Ber能增強MMC抑制T24細胞的增殖能力。腫瘤細胞的生長以及分化必須要求細胞分裂具有嚴格的精確性和定時性，而細胞周期有著嚴格的順序，即從G1→S→G2→M，這其中有若干重要關卡，其中G1/S和G2/M轉換是其中最重要的2個關卡之一，前者稱作啟動點，或者限制點。為了進一步揭示Ber增強MMC抑制T24細胞增殖的機制，本實驗檢測了細胞周期及調控細胞周期的相關蛋白表達情況，發現Ber+MMC組G0/G1期細胞比例較Ber組和MMC組增高，S期細胞比例降低，表明Ber能夠促進MMC引起T24的細胞周期阻滯。目前認為p21和p27是重要的細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑，它們能結合絕大部分的cyclin-CDK復合物，從而抑制其活性，起到調控細胞周期的作用[20-22]。因此我們測定了p21和p27以及其下游的周期調控相關蛋白cyclin D1、CDK2和CDK4蛋白的表達水平。本實驗發現Ber顯著上調p21和p27的表達(P<0.05)，抑制CDK-2、CDK-4和cyclin D1的表達(P<0.05)。這提示Ber能夠促進MMC加強對膀胱癌T24細胞周期抑制作用，其主要機制可能是通過上調p21和p27，進而導致CDK和cyclin D1相關周期蛋白的表達減少，阻斷細胞從G1期向S期進展從而使細胞周期停滯在G1/G0期。Survivin在各種腫瘤細胞中過表達，它不僅能調控細胞周期，且具有抑制細胞凋亡的作用。同時survivin近年來被認為是膀胱癌診斷和預后的一個有價值的指標。它是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis，IAP)家族中最小的成員，不僅具有抑制細胞凋亡的作用，還能調控細胞周期。Western blot結果顯示，Ber+MMC處理T24細胞后其survivin蛋白表達水平較單用MMC和control組均亦顯著下降，Ber能增強MMC誘導膀胱癌T24細胞凋亡。

Ber應用歷史悠久，價格便宜，且研究表明它對正常體細胞具有保護作用，如能利用其優勢開發新的化療藥劑，并進行相關研究，這將為治療膀胱癌提供了新的策略和思路。

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