光學顯微鏡自動聚焦算法研究

呂美妮， 玉振明

(1. 桂林電子科技大學信息與通信學院，廣西 桂林 541004;2. 梧州學院 廣西高校圖像處理與智能信息系統重點實驗室，廣西 梧州 543002)

0 引 言

自動聚焦技術是光學顯微鏡成像系統中至關重要的技術，決定其準確度、效率和穩定性。自動聚焦技術主要分為主動式和被動式[1]。主動式聚焦技術主要通過測量被測物體與成像面的距離，再利用成像原理計算出離焦量。被動式聚焦技術是基于數字圖像處理，通過對采集到的圖像進行數據分析，判斷當前圖像的聚焦程度。由于被動式聚焦技術不需要添加額外的傳感器，僅利用獲取的圖像序列就能進行分析系統的聚焦狀態，因此近年來得到廣泛應用[2]。被動式自動聚焦技術主要分為兩類：一類是聚焦深度法（depth from focus，DFF）；另一類是離焦深度法（depth from defocus，DFD）[3]。DFD需要建立一定的數學模型，通過分析離焦圖像信息，確定模糊程度和離焦圖像的關系，估算出當前位置與聚焦位置的距離。但由于各成像系統的結構不同，建立數學模型所需的參數存在一定的差異，故DFD在實際應用中并不廣泛。而DFF無需建立復雜的數學模型，只需要通過分析圖像的分布特點來靈活選取聚焦窗口以及評價函數，適用性較高。其中，聚焦深度法主要包括3個核心問題：聚焦窗口的選擇，聚焦評價函數的選取和搜索算法的布置[4]。

本文主要研究聚焦窗口的選擇以及聚焦評價函數的選取。在聚焦窗口選擇算法方面，針對傳統的聚焦窗口選擇方法不能靈活選取聚焦區域的問題，提出一種根據圖像子塊梯度幅值總和變化量的聚焦窗口選擇方法。而在選取聚焦評價函數方面，針對傳統的聚焦函數受噪聲影響而引起曲線失去理想特性的問題，提出一種基于梯度和方差的改進算法。

1 聚焦窗口

聚焦窗口的選取直接影響著后續聚焦算法的計算量、復雜度和準確度[5]。傳統的聚焦窗口選擇方法有中央選擇法[6-7]、倒T型選擇法[8]和黃金多點選擇法[9]等。這些方法一般先假設被測目標的位置是固定的，或其分布有一定的規律性，一旦被測目標偏離或是遇到稀疏內容圖像時，傳統的方法具有一定局限性。所以尋求更靈活的聚焦窗口選擇方法成為研究的熱點。

1.1 理論知識

圖像均值可以作為圖像分割的閾值，以此大致區分背景區域和目標區域?；诖嗽?，對顯微圖像序列進行分塊，主要分為零內容子塊（包括邊緣含有部分內容區域，可忽略不計）、稀疏內容子塊（內容區域占子塊內容的比小于等于1/2）和豐富內容子塊（內容區域占子塊內容的比大于1/2）3種。通過分析，不難看出零內容子塊的每個像素灰度值幾乎都大于圖像均值，豐富內容子塊的每個像素灰度值幾乎小于圖像均值，而稀疏內容子塊中，如果是包含較少內容區域，子塊中像素灰度值大于圖像均值的像素個數占多數；反之，如果包含較多內容區域，子塊中像素灰度值小于圖像均值的像素個數占多數。

為了驗證子塊均值與圖像均值之間的關系，本文利用光學顯微鏡XSZ-8100采集內容豐富程度不同的圖像序列（離焦-聚焦-離焦），進行分析整理，數據取其平均值。對圖像內容稀疏的圖像序列，因其含有內容區域的子塊較少，故內容子塊中含內容區域較少的子塊，統一歸為零內容子塊（不考慮玻片雜質的影響）。

從表1可以看出，對于圖像內容豐富和相對豐富的圖像序列，豐富內容子塊的均值一般分布在[E-20,E-10]內，在此范圍內也含有一部分的其他兩類子塊，但豐富內容子塊數量占圖像子塊總數的比例較大，而在小于E-20的范圍內，雖然在此范圍內也含有一部分的其他兩類子塊，但含大部分內容子塊的數量占了很大的比例，并且子塊數量占圖像子塊總數的比例較小，故閾值選取在E-20能初步判定聚焦窗口的大致區域，剔除大量的無用圖像子塊。在圖像內容較稀疏的情況下，因豐富內容子塊較少，閾值選取在任何范圍內，零內容子塊所占的比例較大，故后續介紹的方法適用于除稀疏內容圖像（目標區域零星分布）之外的任意顯微圖像序列。

表1 圖像子塊均值分布范圍表1）%

1.2 聚焦窗口選擇算法

本文的聚焦窗口選擇算法先通過表1設定閾值剔除大量的無用子塊，再根據子塊的梯度幅值總和的變化量確定聚焦窗口。具體步驟如下：

1）對像素大小為M×N的圖像f求圖像均值：

其中f(x,y)為圖像像素點(x,y)處的灰度值。

2）把圖像分割為w×w大小的m×n個子塊，根據式（1）求圖像子塊均值：

其中為圖像子塊坐標。

3）根據子塊均值大小對子塊進行二值化處理：

同時根據子塊二值化結果對圖像塊進行篩選，保留S(i,j)>0的子塊，剔除大量無用的子塊S(i,j)<0。

4）定義圖像在點(x,y)處的梯度為

因此子塊(i,j)的梯度幅值變化總和為

因此沿Z軸移動子塊(i,j)梯度幅值總和差值為

其中H′(i,j)為顯微鏡載物臺沿Z軸移動一小段距離后同一位置子塊的梯度幅值總和。

判斷圖像子塊是否滿足式（4）～式（6），若滿足要求，則從滿足條件的圖像子塊中選取E(i,j)變化最大的兩個圖像子塊作為聚焦窗口。

在聚焦過程中，只有內容像素的梯度幅值發生顯著變化，而雜質像素和背景像素的梯度幅值基本不變[10]。內容子塊的E(i,j)變化較為明顯，零內容子塊的E(i,j)基本不變（或在一定的范圍內波動），故選取E(i,j)變化最大的兩個子塊作為最終的聚焦窗口。

2 聚焦評價函數

傳統的聚焦函數分為3類：梯度類評價函數、頻域類評價函數和統計類評價函數[11-12]。其中基于頻域的聚焦評價函數比較復雜，計算量大，在實際應用中并不多。而基于梯度類函數與統計類函數因計算簡單，在實際應用較為廣泛。

傳統的聚焦評價函數易受噪聲的影響，引起函數性能下降，進而導致聚焦的不準確。本文提出一種基于梯度和方差的改進算法，該算法將梯度評價函數與方差評價函數結合，利用每個像素的權重進行加權，計算簡單且能提高其靈敏度、清晰度比率和抗噪性。

在傳統的聚焦評價函數中，Tenengrad函數是性能比較優異的梯度類函數。該函數基于Sobel算子，由于Sobel算子結合了高斯平滑和微分，所以Tenengrad函數對噪聲具有很強的穩健性。故本文選用性能較好的Tenengrad函數來構建新的聚焦評價函數。

對圖像f每個像素點(x,y)的水平及垂直差分進行平方運算，在一定程度上可起到抗噪聲的作用。

其中gx(x,y)和gy(x,y)分別表示圖像與水平和垂直Sobel算子的卷積。

由于清晰圖像一般比離焦圖像具有更大的梯度變化，因此圖像的梯度值方差同樣也可以區分內容像素和背景像素。故對每個像素點的p(x,y)進行求方差，方差反映數據波動的大小，可看出每個像素點p(x,y)的偏離程度。

其中是圖像每個像素點p(x,y)的平均值。

不同的像素有不同的作用，而在聚焦過程中，背景像素和雜質像素會影響聚焦函數的曲線性能，為了減少其影響，對q(x,y)用像素的灰度值權重進行加權。

其中T為圖像的灰度平均值，F為聚焦評價函數值。在聚焦過程中，背景像素和雜質像素的灰度值基本不變（或變化很?。?，而內容像素的灰度值發生顯著的變化。利用這個性質，可以發現在聚焦過程中，內容像素的灰度值權重越來越大。通過對q(x,y)進行加權，使得內容像素的q(x,y)比重加大，而背景像素和雜質像素的q(x,y)比重減少，進一步突出了聚焦圖像和離焦圖像的區別，在一定程度上提高了聚焦函數的靈敏度。

3 實驗與分析

本文實驗壞境為：CPU，Intel（R）Core（TM）i7-6700 3.4GHz；RAM，8.00GB；Matlab（R2014a）。

本文實驗圖片（480×640）均通過梧州奧卡光學儀器公司研發的光學顯微鏡（XSZ-8100）進行采集。實驗中選用2組圖像大小為480×640的顯微圖像序列（離焦-聚焦-離焦），聚焦圖像如圖1（a）～圖1（b）所示。圖中所示的圖像序列，最佳聚焦位置在第41幀。

圖1 顯微圖像序列

圖2 取窗方法對比曲線圖

3.1 聚焦窗口選擇實驗

為了驗證本文方法的有效性，分別與中心選擇法、多點選擇法和倒T選擇法進行對比實驗，聚焦評價函數采用性能優異的Tenengrad函數。實驗仿真結果如圖2所示。

從實驗結果來看，對于內容豐富的圖像序列(圖1（a）），傳統的方法和本文方法都能夠使聚焦評價函數曲線具有單峰性，不存在局部峰值。這是由于圖像內容豐富，傳統的取窗方法也能納入更多的圖像內容。而當被測物體偏離中心區域（圖1（b）），在取窗足夠大的情況下，傳統的取窗方法能納入一部分的圖像內容，但由于納入的非內容區域過多，會導致曲線出現局部極值，而本文方法的曲線還能保持曲線的單峰性?？梢姳疚姆椒艽_保選取到含有大量內容區域的子塊作為聚焦窗口。

3.2 聚焦函數性能實驗

3.2.1 仿真實驗

為驗證本文函數的性能，選取Variance函數[13]、Robert函數[14]、EOG函數[15]、Tenengrad函數[15]以及文獻[16]的SV函數（Sobel函數和方差函數結合）進行對比實驗。聚焦窗口的選取方法則選用本文1.2所提的方法。圖3（a）是無噪聲情況下的仿真曲線。圖3（b）則是圖像序列加入隨機噪聲的仿真曲線。

圖3 聚焦函數仿真曲線圖

由圖可知，當無噪聲干擾時，傳統的聚焦評價函數和本文函數均滿足單峰性和無偏性，且保持理想曲線的特性，但本文函數靈敏度更高。當有噪聲干擾時，本文函數的仿真曲線還能保持單峰性和無偏性，且平緩區波動較小，而其他評價函數的仿真曲線波動較明顯，失去理想曲線的特性，說明本文函數具有較好的穩定性。

3.2.2 結果分析

為了驗證本文算法性能上的改進，利用文獻[15]中提出的評價指標對各聚焦函數進行定量分析。

清晰度比率表達式為

其中Fmax和Fmin為聚焦函數的最大值和最小值（最小值應在聚焦曲線的平緩區取得）。

靈敏度因子表達式為

其中x1為橫坐標變化量，xmax為函數最大值的橫坐標。

首先假設采樣點有N個（曲線的平緩區取得），則定義N個點的函數值標準差為平緩區波動量，其表達式為

其中為平緩區的灰度均值。

對各函數進行定量分析如表2所示，給出在隨機噪聲的影響下，各函數的清晰度比率（R）、靈敏度因子（S）、平緩區波動量（V）和處理時間（T）。

表2 圖像在噪聲干擾下各聚焦函數性能指標

從表2可以看出，本文函數的靈敏度明顯高于其他函數，說明本文函數在有噪聲的影響下，函數最大值附近變化劇烈，適用于細聚焦過程。本文函數的清晰度比率明顯高于其他函數，說明本文函數在有噪聲的情況下，對不同離焦程度的圖像分辨能力強，這也說明該函數抗噪聲能力較強。本文函數的平緩區波動量小，說明該函數在噪聲的干擾下還能保持平緩區波動平衡，穩定性較強。從時間來看，本文函數相比于傳統聚焦評價函數，時間相差不大。本文提出的算法是基于文獻[16]的基礎上進行改進的，相比于文獻[16]的SV算法，本文算法的清晰度比率、靈敏度因子和平緩區波動量都有了提高，并且實驗用時比SV函數少。

從以上分析的結果來看，本文提出的算法在抗噪性、靈敏度和穩定性方面具有一定的優勢，且適用于光學顯微成像系統。

4 結束語

在光學顯微鏡系統聚焦的過程中，傳統的聚焦窗口選擇方法并不能滿足聚焦的要求，一旦目標區域偏離中心區域或是目標區域較小，往往都會導致聚焦失敗。本文提出的新算法能選取到含內容區域較多的圖像塊作為聚焦窗口。聚焦評價函數是自動聚焦的核心問題之一，一個理想的聚焦函數，應該滿足無偏性、單峰性和抗噪性。本文提出的算法在噪聲的干擾下，具有較高的靈敏度、穩定性和抗噪性。綜上，本文提出的聚焦窗口選取方法以及聚焦評價函數適用于顯微成像系統中。

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