姬松茸多糖誘導巨噬細胞釋放NO的機制

房雷雷 趙肖通 張彥青 解軍波

(1. 天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134；2. 天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134)

一氧化氮(nitric oxide, NO)是一種新型生物信息傳遞分子，可由單核巨噬細胞RAW264.7等產生，在免疫、循環、呼吸、神經等系統中發揮重要作用，已成為當代生物學研究的一大熱點[1]。試驗證明，真菌多糖具有較強的免疫活性，且大多數真菌多糖能夠增強機體免疫力[2-4]，其中重要途徑之一是促進巨噬細胞產生細胞因子和免疫活性物質(如NO等)[5-7]。

姬松茸(Agaricusbrasiliensis)別名巴西蘑菇、小松菇、柏氏蘑菇，屬擔子菌亞門，層菌綱，傘菌目，蘑菇科，蘑菇屬，為現今世界上可人工栽培的珍稀藥食兼用菌之一[7]。研究[8]發現姬松茸對免疫系統有重要的調節作用，對非特異性免疫、特異性免疫和細胞免疫體系均有增強作用。在姬松茸的免疫調節作用中，姬松茸的多糖成分為主要活性成分，且大量文獻[9-10]證明姬松茸多糖能在多條途徑和多個層面顯示免疫活性。

姬松茸多糖免疫調節作用的相關研究大多集中于具體表征而非探究其機制，且多以小鼠單核巨噬細胞RAW264.7建立細胞模型，一些研究結果已經表明姬松茸多糖能夠促進巨噬細胞增值、釋放NO和分泌腫瘤壞死因子(Tumor nerosis factor-α, TNF-α)、γ-干擾素(Interferon-γ, IFN-γ)、白細胞介素1(Interleukin-1-β, IL-1β)與白細胞介素8(Interleukin-8, IL-8)等[11-13]。本試驗擬建立小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞模型，分析姬松茸多糖對巨噬細胞NO釋放與誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)表達的影響，同時研究其對NF-κB抑制蛋白(IκBα)磷酸化水平的影響，從姬松茸多糖影響NF-κB信號傳導途徑的角度出發，深入探討姬松茸多糖誘導巨噬細胞釋放NO的機制，以期為開發姬松茸多糖提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姬松茸多糖樣品：多糖含量為99%，實驗室自制；

脂多糖( Lipopolysaccharides, LPS)：美國Sigma公司；

全蛋白提取試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司；

DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)培養基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素：美國Gibco公司；

山羊p-IκBα抗體：美國Santa Cruz公司；

BCA蛋白濃度測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；

兔iNOS、(HRP)-共軛抗山羊二抗抗體：美國Thermo公司；

兔β-actin抗體、抗兔二抗抗體：北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

電子分析天平：BP211D型，德國Sartoriμs公司；

超純水系統：Milli-Q型，美國Millipore公司；

多功能酶標儀：SpectraMax?M3型，美國Molecular Devices公司。

1.3 溶液配制

DMEM完全培養液：分別向DMEM培養基中加入終濃度為10%和1%的胎牛血清和青鏈霉素雙抗，保存于4 ℃冰箱中；

亞硝酸鈉溶液：稱取適量亞硝酸鈉，并用DMEM完全培養液溶解，溶解完全后配制成終濃度為1 mmol/L亞硝酸鈉儲備液，并稀釋成5，10，25，50，75，100 μmol/L，于4 ℃冷藏備用；

Griess溶液：稱取適量Griess試劑并溶于250 mL蒸餾水中，配制成濃度為40 mg/mL的溶液，0.22 μm微孔濾器過濾除菌，分裝，放置于4 ℃冰箱避光保存；

LPS溶液配制：稱取LPS脂多糖標準品粉末，加入DMEM完全培養液溶解，溶解后混勻，得到終濃度為1 μg/mL 的LPS溶液，過濾除菌，冷藏備用；

姬松茸多糖溶液配制：精密稱取姬松茸多糖樣品10 mg，將樣品置于10 mL的容量瓶中，用DMEM完全培養液稀釋并定容，制得1 mg/mL的姬松茸多糖儲備液，配制成不同濃度溶液(6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL)，過濾后冷藏。

1.4 方法

1.4.1 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7的培養 培養基為DMEM完全培養液，細胞放置于10 cm的細胞培養皿中，于37 ℃恒溫培養箱，通入5% CO2中培養(相對濕度90%)。細胞每隔1～2 d傳代一次，試驗接種細胞為對數生長期細胞。

1.4.2 RAW264.7細胞釋放NO的測定 運用Griess試劑測定NO的釋放量，研究姬松茸多糖對巨噬細胞NO釋放作用的影響。

(1) NO標準曲線的測定：取75 μL不同濃度(0，5，10，25，50，75，100 μmol/L)的亞硝酸鈉置于96孔板，每孔再加入75 μL Griess溶液，混勻后靜置3 min后，采用酶標儀檢測540 nm處吸光度。

(2) 將培養的RAW264.7細胞懸液(5×105個/mL)以每孔100 μL接種于96孔板，并培養24 h。然后，用姬松茸多糖樣品處理2組細胞：一組是將細胞在1 μg/mL LPS和姬松茸多糖溶液(濃度分別為0.00，6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL)下培養24 h；一組是將25 μg/mL的姬松茸多糖溶液加入細胞后分別培養2，4，6，8，10，12，16，24，30，36 h。而后，吸取75 μL上清液于新96孔板中，并添加 Griess溶液、混勻、靜置，而后測定吸光度，并根據標準曲線計算得到NO濃度。

1.4.3 RAW264.7細胞iNOS表達的測定 收集已加入0.00，6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL姬松茸多糖溶液培養24 h的巨噬細胞，采用全蛋白提取試劑盒提取RAW264.7細胞全蛋白，并選用BCA試劑盒檢測其蛋白含量。蛋白質免疫印跡法(Western Blot，WB)[14]測定iNOS的表達量(β-actin為參比蛋白)，而后采用凝膠成像系統處理膠片，并運用Quantity One軟件分析試驗結果。WB試驗選用抗體為：兔iNOS、兔β-actin抗體、抗兔二抗抗體。

1.4.4 RAW264.7細胞p-IκBα蛋白表達的測定 采用WB法測定，姬松茸多糖濃度為25 μg/mL，姬松茸多糖作用巨噬細胞時間為0，15，30，45，60 min，所選用抗體為山羊p-IκBα抗體與(HRP)-共軛抗山羊二抗抗體，其他試驗步驟同1.4.3。

1.4.5 數據處理 上述所有試驗均重復6次，數據用“平均值±SD”表示，數據統計分析采用SPSS軟件，并選用單因素方差分析(ANOVA)中LSD最小顯著差法檢驗組間差異性。所有圖像采用Microsoft Office Excel 2007軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 姬松茸多糖誘導RAW264.7細胞釋放NO

采用Griess法對巨噬細胞NO釋放量進行檢測，并以各濃度亞硝酸鈉為底物，利用Griess試劑測定吸光度值，得NO標準曲線為y=0.018x+0.010(R2=0.999)。

通過亞硝酸鈉標準曲線計算得到各組NO濃度，結果見圖1。由圖1(a)可知，25 μg/mL姬松茸多糖作用RAW264.7細胞36 h內，NO濃度隨作用時間的延長而逐漸增加，具有較強的時效性。圖1(b)表明，與空白對照組相比，6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL姬松茸多糖作用24 h后， RAW264.7細胞NO釋放量極顯著增大(P<0.01)，且作用效果隨劑量的增大而增強。以姬松茸多糖濃度為x值，以NO濃度為y值進行線性分析，得到回歸方程為y=0.130 2x+2.35，判定系數R2為0.736 6，表明姬松茸多糖對NO釋放的影響具有一定程度的線性關系。綜上表明，姬松茸多糖能夠誘導RAW264.7細胞釋放NO，且具有一定的時效性和劑量依賴性。

研究[15]表明，NO的釋放是巨噬細胞的非特異性免疫——一種重要的機體防御過程的重要環節，當受到如腫瘤細胞、病原體及微生物等刺激時，巨噬細胞被活化并產生一系列的效應分子，NO便是其中之一。一方面，NO被作為巨噬細胞發揮殺傷靶細胞的重要信使分子，通過細胞間信息交換載體功能發揮免疫調節作用；另一方面，NO對巨噬細胞吞噬的各類腫瘤細胞與微生物等具有細胞毒性[16]。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的主要成分，能夠誘導巨噬細胞釋放NO等多種因子參與免疫反應[17]。本試驗結果顯示姬松茸多糖作用后能夠顯著促進RAW264.7細胞釋放NO，與相關文獻[11-12]報道姬松茸多糖對巨噬細胞NO生成的試驗結果相一致，說明姬松茸多糖對巨噬細胞的免疫活性有正向的促進作用?？梢?，姬松茸多糖能夠通過增加巨噬細胞NO的釋放而調節機體的免疫反應。

圖1 姬松茸多糖對巨噬細胞釋放NO作用的影響

Figure 1 The effects ofAgaricusbrasiliensispolysaccharide on NO production in RAW264.7 cells

2.2 姬松茸多糖對RAW264.7細胞iNOS表達水平的影響

iNOS催化L-精氨酸生成NO，是哺乳動物體內NO合成的唯一途徑[18]，故本研究選用Western Blot法進一步檢測姬松茸多糖對巨噬細胞iNOS表達量的影響，以β-actin為內參蛋白。由圖2可知，與空白對照組相比，不同濃度姬松茸多糖(0.00，6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL)作用24 h后，能夠明顯增強RAW264.7細胞中iNOS的表達水平(P<0.01)。線性分析得回歸方程為y=0.106 4x+3.052 3，判定系數R2=0.649 1，證明不同濃度姬松茸多糖作用后，對RAW264.7細胞iNOS表達水平的影響有一定的劑量依賴性。說明姬松茸多糖能夠顯著誘導巨噬細胞合成iNOS，且呈現劑量依賴性。

此外，iNOS表達量與NO釋放量的量效關系呈現一致的趨勢，進一步驗證了姬松茸多糖能夠誘導RAW264.7細胞表達iNOS蛋白進而大量釋放NO。

Figure 2 The effects ofAgaricusbrasiliensispolysaccharide on iNOS protein expression in RAW264.7 cells

2.3 姬松茸多糖對RAW264.7細胞IκBα蛋白磷酸化水平的影響

NF-κB具有多項調節作用，是iNOS基因轉錄與表達的調控因子，靜息狀態下保持P50-P65-IκB三聚物的形式。當收到活化信號后，IκB的絲氨酸殘基被磷酸化，并從NF-κB解離進入胞核，起到活化轉錄因子的效用[18]。而后，P50-P65二聚體與κB基序結合，表現出一系列重要生物學、病理學活性[19]。

如圖3所示，25 μg/mL的姬松茸多糖處理RAW264.7細胞不同時間(0，15，30，45，60 min)后，p-IκBα蛋白的含量隨處理時間的延長而增加，45 min時達到最高，表明姬松茸多糖可以引起IκBα蛋白磷酸化水平的升高，表示姬松茸多糖能夠誘導IκBα蛋白的磷酸化，從而證明姬松茸多糖能夠激活NF-κB信號轉導途徑。

圖3 姬松茸多糖對RAW264.7細胞IκBα蛋白磷酸化 水平的影響

Figure 3 Effects ofAgaricusbrasiliensispolysaccharide on phosphorylation of IκBα protein in RAW264.7 cells

研究[20]表明，iNOS蛋白的表達、NO的釋放與NF-κB信號轉導通路的活化密切相關，NF-κB/IκB途徑在其中起重要作用，故由試驗結果可推測姬松茸多糖能夠通過激活巨噬細胞NF-κB通路誘導其合成iNOS從而促進釋放NO。

3 結論

本試驗以巨噬細胞釋放NO的行為變化為靶點，檢測姬松茸多糖的免疫調節作用并探究其機制。試驗結果顯示，姬松茸多糖作用于小鼠巨噬細胞RAW264.7后，可通過激活NF-κB信號轉導通路上調iNOS蛋白的表達，進而促進NO釋放，從而發揮免疫調節作用，作用效果顯著且具有良好的時效和量效性。本文選用了NF-κB信號轉導通路探究姬松茸多糖對巨噬細胞的NO釋放作用的影響機制，在后續的研究中，將對多糖的免疫活性及其他相關信號通路與機理等做進一步深入的探索。