嗜酸芽孢桿菌普魯蘭酶在大腸桿菌中的表達及發酵優化

楊向會 陳 晟 吳 敬

(1. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3. 江南大學教育部食品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 無錫 214122)

普魯蘭酶是一種脫支酶，能夠專一地水解支鏈淀粉(或普魯蘭多糖等相關聚合物)中α-1,6-糖苷鍵[1]，所以普魯蘭酶在淀粉加工工業得到了廣泛的應用。普魯蘭酶與淀粉水解酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶)復配使用時，淀粉質原料的利用率明顯提高，對節約成本和提高產物轉化率有重要意義，因此普魯蘭酶是淀粉加工中不可或缺的非大宗關鍵酶制劑[2-3]。

早期國內外有關普魯蘭酶的研究主要集中在菌株的篩選上[4-6]，許多產普魯蘭酶的微生物被發現，但由于多數的野生菌株發酵產普魯蘭酶的酶活較低，限制了其在工業上的應用。因此，對野生菌來源的普魯蘭酶在工程菌中進行異源表達，以提高蛋白表達量，成為目前研究主流。至今已從多種微生物中克隆出普魯蘭酶基因并對其進行異源表達[7-8]，但重組后的普魯蘭酶表達仍存在產量低或不能有效分泌的問題。為解決此類問題，Duan等[9]通過分階段控制發酵溫度和添加甜菜堿的方法，使普魯蘭酶的可溶性表達量和胞外分泌得到顯著提高。Zou等[10]通過流加甘氨酸使普魯蘭酶的胞外酶活提高了22.6倍。來源于Bacillusacidopullulyticus的普魯蘭酶具有良好的酶學性質(耐酸，耐熱)，最適溫度60 ℃，最適pH 5.0，可以和多種淀粉水解酶復配使用，能夠滿足淀粉工業應用的要求。大腸桿菌表達系統具有蛋白表達水平高、易于高密度發酵等眾多優點[11]，已有多達60%的重組蛋白在大腸桿菌系統中進行表達[12]。

Chen等[13]在大腸桿菌中重組表達來源于Bacillusacidopullulyticus的普魯蘭酶，并在5 L發酵罐水平進行發酵，在發酵溫度20 ℃條件下酶活達1 156 U/mL；其誘導溫度過低無法在工業上實現大規模生產；針對此問題，本研究擬將Bacillusacidopullulyticus普魯蘭酶在大腸桿菌中進行重組表達，并對重組菌進行3 L發酵罐發酵優化，在本研究中采用工業生產上可實現的發酵溫度25 ℃，大幅度提高了普魯蘭酶的表達量和胞外酶活，以期為普魯蘭酶的工業應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌E.coliJM 109和BL21(DE3)：本實驗室保藏；

帶有NcoⅠ和Hind Ⅲ酶切位點的重組質粒pET20b(+)-BapulA：由上海捷瑞公司合成，其中普魯蘭酶基因BapulA(GeneBank Accession No.Ax203843.1)來源于Bacillusacidopullulyticus。

1.1.2 培養基

搖瓶TB培養基：K2HPO4·3H2O 16.43 g/L，KH2PO42.31 g/L，酵母粉24 g/L，甘油5 g/L，蛋白胨12 g/L，甜菜堿2.4 g/L；

發酵罐基礎培養基：KH2PO413.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.4 g/L，(NH4)2HPO44.0 g/L，C6H8O7·H2O 1.7 g/L，工業酵母粉2 g/L，工業蛋白胨1 g/L，甘油8 g/L，微量金屬液10 mL，甜菜堿5 g/L；

發酵罐補料培養基：MgSO4·7H2O 18.35 g/L，工業酵母粉4.8 g/L，甘油600 g/L，工業蛋白胨2.4 g/L。

1.1.3 主要試劑

NcoⅠ和Hind Ⅲ：分子級，寶生物工程(大連)有限公司；

普魯蘭多糖：分析純，東京化成工業株式會社；

甘氨酸：分析純，國藥化學試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器

發酵罐：BioFlo /celliGen115型，德國Eppendorf NBS公司；

高效液相色譜系統：安捷倫1200型，美國Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 搖瓶培養 將菌株從甘油管中接種于LB培養基中，在37 ℃，200 r/min下培養8 h。以5%的接種量轉接至50 mL TB培養基內，在200 r/min，37 ℃下，OD600為1.0～1.2 時，加入0.05 mmol/L的IPTG誘導，25 ℃培養48 h。

1.2.2 發酵罐培養

(1) 種子培養：將菌株從甘油管中接種至100 mL LB培養基中，37 ℃，200 r/min下培養8～9 h。

(2) 3 L發酵罐培養：將種子培養液按10%接種量接種至發酵罐中，加入終濃度為100 μg/mL的氨芐霉素，初始溫度設定為30 ℃或37 ℃，維持溶氧30%，通過補加氨水來維持pH為7.0。當發酵罐中甘油耗盡，溶氧快速反彈時，開始流加補料培養基。當OD600分別達到25，50，75時，降溫至25 ℃，此時調節pH 到6.2，同時以一定流速流加乳糖進行誘導，期間用20%的磷酸和氨水控制pH為6.2。在發酵過程中，當OD600達到15，45，75，105時，根據試驗需要補加一定量的甘氨酸。

1.3 分析方法

1.3.1 普魯蘭酶酶活力的測定 將0.1 mL稀釋一定倍數的普魯蘭酶液(空白加高溫滅活的普魯蘭酶)加入到1.9 mL的普魯蘭多糖溶液中，60 ℃反應10 min，加入3 mL的DNS溶液終止反應后，在沸水中反應7 min，加去離子水補足15 mL。在540 nm波長處測吸光值。普魯蘭酶酶活定義為：每分鐘生成1 μmol還原糖的酶量定義為一個酶活力單位。

1.3.2 甘氨酸含量的測定 將待測發酵液在12 000 r/min離心5 min，棄沉淀，在上清液中按1∶1的體積比加入100 g/L 的三氯乙酸。充分混勻后，在室溫下靜置2 h，12 000 r/min 下離心40 min，將離心后的上清液過濾，所得樣品即可用于高效液相(HPLC)檢測。

色譜條件：色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm × 4.6 mm)，柱溫40 ℃，流速0.8 mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長338 nm，洗脫方式為梯度洗脫。

2 結果與分析

2.1 重組菌株的構建與發酵

將質粒pET20b(+)-BapulA熱激轉化E.coliBL21(DE3)感受態，涂布于帶有氨芐霉素抗性的平板，挑選單菌落至10 mL LB培養基中，培養8 h提取質粒，并用NcoⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切驗證，結果見圖1。從圖1(a)可知，電泳條帶與理論值一致，表明重組質粒轉化宿主菌成功，得到重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-BapulA。將該菌株進行搖瓶發酵，培養48 h后取發酵液進行離心、破壁。胞外上清和胞內上清中的最高酶活分別為6.5，35.6 U/mL，最高總酶活為41.1 U/mL。將胞外上清、胞內上清進行蛋白電泳檢測[見圖1(b)]，條帶大小均與重組蛋白理論分子量(約102 kDa)一致，表明來源于Bacillusacidopullulyticus的普魯蘭酶在大腸桿菌中成功表達。

M. 蛋白Marker (200 kDa) 1. 胞外上清 2. 胞內上清圖1 重組大腸桿菌的構建和重組普魯蘭酶的SDS-PAGE

Figure 1 Construction of recombinantE.coliand SDS-PAGE analysis of recombinant pullulanase

2.2 生長階段溫度對重組菌生長和產酶的影響

在3 L發酵罐高密度發酵生產重組普魯蘭酶的過程中，本研究對重組菌生長階段分別采取不同的培養溫度以探究溫度對重組菌生長及產酶的影響，結果見圖2。重組菌生長階段的溫度分別為30，37 ℃，誘導溫度均為25 ℃。與起始發酵溫度37 ℃相比，起始發酵溫度在30 ℃條件下最終菌體生物量(OD600)略低，見圖2(a)。從圖2(b)～(d)可知，與生長階段溫度為37 ℃相比，在生長階段溫度為30 ℃條件下更有利于產酶，該條件下普魯蘭酶的最高胞內酶活和胞外酶活分別達684.1，240.1 U/mL，最高總酶活為890.6 U/mL。據報道，pET-20b(+)質粒在表達外源蛋白時往往伴隨著目的蛋白的本底表達[11]，重組大腸桿菌在較低溫度下的生長會通過減少形成無活性的包涵體來提高可溶性蛋白的比例[14]，而在較高的生長溫度下目的蛋白的本底表達會引起宿主細胞的應激反應，這種應激反應最終導致目的蛋白形成聚集體并在細胞內積累，這對發酵后期菌體的產酶不利[11]。因此，在發酵過程中控制菌體的生長階段溫度為30 ℃。

2.3 誘導階段pH對重組菌生長和產酶的影響

大腸桿菌生長過程中，pH過高或者過低，都會導致菌體生長異常，需要控制pH范圍以保證菌體正常生長和產酶。因此，本研究在分別控制誘導階段pH為6.2，7.0的條件下，考察了pH對重組菌生長和產酶的影響，結果見圖3。

在重組菌的搖瓶發酵過程中，當發酵液的pH>7.0時，普魯蘭酶的酶活力迅速下降，在48 h發酵結束后，酶活僅為3.2 U/mL[見圖3(a)]。若在發酵過程中，每隔一段時間，通過添加20%磷酸以維持發酵液的pH 在6.2～7.0，普魯蘭酶的活力會隨著發酵時間的延長而增加，普魯蘭酶的酶活最高達201.0 U/mL。重組普魯蘭酶的最適pH為5.0，當pH過高時，重組酶酶活顯著下降[15]。從圖3(b)中可以看出，重組酶在室溫放置48 h后，pH 6.2下的該酶殘余酶活顯著高于pH 7.0的。綜上，發酵液pH維持在6.2最佳。

從搖瓶發酵結果可以看出，誘導階段發酵液的pH顯著影響重組菌產酶，因此在重組菌3 L發酵罐發酵過程中需對誘導階段的pH進行優化。與誘導階段發酵液pH為7.0時相比，pH為6.2，盡管菌體生物量有所降低[見圖3(c)]，但是在該條件下普魯蘭酶最高胞內酶活[見圖3(d)]、胞外酶活[見圖3(e)]和總酶活[見圖3(f)]分別是pH 7.0 條件下的1.12，17.65，1.40倍。

2.4 乳糖流加速率對重組菌生長和產酶的影響

鑒于乳糖誘導強度對目的蛋白表達有重要影響，本研究對乳糖流加速率進行了優化，結果見圖4。從圖4(a)可知，當乳糖流加速度為0.2，0.4 g/(L·h)時，最高菌體濃度(OD600)分別為129，120；而當乳糖流加速率為0.6 g/(L·h)時，菌體濃度(OD600)顯著降低，說明低誘導強度對重組菌生長影響較小，而較高的誘導強度則可能由于代謝壓力大而導致菌體濃度降低。由圖4(b)～(d)可以看出，乳糖的流加速率對重組菌產酶也有顯著影響，誘導強度過低或過高都不利于產酶，最佳的乳糖流加速率是0.4 g/(L·h)，在此條件下，普魯蘭酶的最高胞內酶活和胞外酶活分別達到684.1，240.1 U/mL，總酶活達到890.6 U/mL。

圖3 pH對重組菌生長和產酶的影響以及室溫下重組普魯蘭酶的pH穩定性Figure 3 Effect of pH on OD600 and pullulanase production in induction stage and pH stability of recombinant pullulanase at room temperature

2.5 誘導時間對重組菌生長和產酶的影響

誘導時間也是影響大腸桿菌表達重組蛋白的條件之一，合適的誘導時間既可使菌體高效生長，又不影響目的蛋白的產量[16]。本研究發現，盡管在菌體OD600為15時，向發酵液中加入7.5 g/L甘氨酸，但是胞外分泌效率依然較低。因此，分別在菌體濃度OD600達到25，50，75時開始誘導，考察了誘導時間對重組菌生長和產酶的影響，結果見圖5。

從圖5可知，當誘導OD600為25，50時，重組菌最終生物量均較低，而當誘導OD600為75時，菌體濃度顯著提高。在重組菌產酶過程中，誘導OD600為25時，菌體產酶最低，可能是菌體濃度較低時誘導易導致菌體過早產酶，因而不利于菌體的良好生長，最終影響產酶，重組酶酶活偏低。當誘導OD600為50時，重組普魯蘭酶的最高胞內酶活和胞外酶活分別為684.1，240.1 U/mL，總酶活達到890.6 U/mL；在誘導OD600為75時，重組酶酶活下降，可能是在菌體濃度過高時誘導，菌體的細胞膜通透性變差，不利于目的蛋白的轉運。綜合菌體生長和產酶情況，最佳誘導時間為OD600達到50時。

2.6 分批加入甘氨酸對重組菌生長和產酶的影響

雖然通過以上多個條件的優化，普魯蘭酶的表達量得到了大幅度提高，但是大部分蛋白都位于周質空間，并未分泌到胞外?？赡苁怯捎趐ET-20b(+)載體上的PelB信號肽主要用于外源蛋白在周質空間的積累，難以到達胞外；或者所用條件不利于重組酶分泌[7]。為了提高胞外表達水平，需要研究增強胞外分泌的方法，本研究嘗試加入甘氨酸以提高胞外酶活。文獻[17]報道，在培養基中添加一定濃度甘氨酸有助于普魯蘭酶的胞外分泌，而高濃度(>5 g/L)的甘氨酸則會抑制菌體生長。因此，通過分批加入適量的甘氨酸以維持發酵液中的甘氨酸濃度在1～5 g/L，可能達到既不影響菌體生長，又能促進目的蛋白胞外分泌的目的。甘氨酸優化的具體策略如下：① 在菌體濃度OD600依次達到15，45，75時分別加入濃度為1.5 g/L的甘氨酸，菌體濃度OD600達到105時，再加入濃度為3 g/L的甘氨酸；② 在菌體濃度OD600依次達到15，45，75時分別加入濃度為2.5 g/L的甘氨酸，菌體濃度OD600達到105時，再加入濃度為5 g/L的甘氨酸；③ 在菌體濃度OD600依次達到15，45，75時分別加入濃度為4 g/L的甘氨酸，菌體濃度OD600達到105時，再加入濃度為8 g/L的甘氨酸，結果見圖6。

圖4 乳糖流加速度對重組菌生長和產酶的影響Figure 4 Effect of lactose flow rates on OD600 and pullulanase production

圖5 誘導時間對重組菌生長和產酶的影響Figure 5 Effect of induced point on OD600 and pullulanase production

從圖6 可知，與策略②和策略③相比，在策略①的條件下，菌體濃度和胞內酶活、胞外酶活以及總酶活均為最高。在此策略下加入到發酵液中的甘氨酸濃度較低，在之后的短時間內甘氨酸即被耗盡[見圖6(e)]，表明加入低濃度的甘氨酸可在不影響重組菌生長的同時促進重組酶的胞外分泌；最終最高胞外酶活和胞內酶活分別達到659.0，1 331.2 U/mL，最高總酶活為1 910.1 U/mL。甘氨酸能使細胞膜的通透性增強，有效促進目的蛋白分泌，但較高濃度的甘氨酸易導致菌體生長受到抑制，菌體濃度和產酶也隨之降低。研究結果表明，分批加入適宜濃度的甘氨酸可有效促進普魯蘭酶的胞外分泌，從而提高普魯蘭酶的可溶性表達，因此，采用策略①來提高重組普魯蘭酶可溶性表達和胞外分泌是可行的。

3 結論

本研究的目的是在3 L發酵罐水平上提高重組菌E.coliBL 21(DE3)/ pET20b(+)-BapulA的普魯蘭酶的表達量和胞外分泌。重組蛋白在大腸桿菌中的表達會受到多因素的影響，如發酵過程中的溫度、pH和誘導濃度等。經過以上策略的優化，重組普魯蘭酶的最高總酶活達到1 910.1 U/mL，與搖瓶最高總酶活相比，提高了9.5倍。在后續研究中，還可通過選擇其他表達載體，以減少重組酶本底表達；或者優化信號肽，以期獲得高效的重組蛋白胞外分泌效率，為普魯蘭酶的工業應用提供依據。

圖6 甘氨酸濃度對重組菌生長產酶的影響以及發酵液中甘氨酸殘余濃度Figure 6 Effect of glycine concentration on OD600 and pullulanase production and glycine residues in fermentation broth