酶制劑對全麥饅頭面團水相溶液理化性質的影響

江志堅 劉麗婭 丁 嵐 周素梅 王 立

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193)

阿拉伯木聚糖(AX)是存在于小麥細胞壁中的一種非淀粉、非纖維多糖，占全麥粉的6%～8%。根據溶解性，AX分為可溶性阿拉伯木聚糖(WEAX)和不可溶阿拉伯木聚糖(WUAX)。前人[1]研究表明，AX并不是普通的“惰性”纖維基質，它具有高吸水性、高黏彈性以及氧化凝膠等功能特性，對小麥面團、面制品品質有著重要影響。戊聚糖酶(Pn)是一種β-1,4-D-戊聚糖內切酶，其對面包品質改良作用早在20世紀90年代就得到公認。實踐證明，戊聚糖酶具有提高面團機械加工性能，增大面包體積及延緩面包老化等功能[2]。謝潔等[3]研究顯示在含8%麩皮的全麥饅頭中添加Gox能夠使饅頭結構松軟，口感更加細膩，更富有彈性。

質構是發酵面制品最重要的品質特性之一，均一且細膩的氣室結構是衡量其品質優劣的關鍵因素。大量研究[4]表明發酵面制品的質構特性，尤其是產品內部氣室結構主要與面筋網絡的流變學性質相關。此外，面團氣體分散相與面筋網絡半固態連續相基質之間存在黏彈性薄層液膜結構[5]。該液膜結構起源于面團水相，富含可溶性蛋白、WEAX等水溶性物質，液膜結構對面團調質時氣體的滲透、發酵和醒發期間氣泡的膨脹、以及面團焙烤過程中氣泡黏彈性具有不同程度的影響。最新的研究[6]表明，面團水相體系是形成薄層液膜的物質基礎，因此將其作為研究液膜性質的理想材料。

面團水相體系中富含WEAX，AX相關酶制劑Pn、Gox能對水相組成及性質產生不同程度的影響。然而，Pn、Gox對面制品改良作用是否與面團水相性質改變有關尚不清楚。本實驗室前期研究了Pn和Gox單一或協同作用全麥饅頭品質的變化，并從酶制劑對面筋網絡結構的調控角度揭示了改良機制。本研究旨在從酶制劑引起的面團水相溶液理化性質變化層面，通過研究全麥面團水相溶液物質組成，面團水相溶液泡沫穩定性、微觀形貌等理化特性的變化，進一步補充完善基于AX酶法改性的全麥饅頭品質改良機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

小麥籽粒：津強，北京古船食品有限公司；

低糖高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；

葡萄糖氧化酶(GLUZYME Mono 10000 BG)：10 000 GODU/g，諾維信生物技術有限公司；

戊聚糖酶(Pentopan Mono BG)：2 500 FXU(W)/g，諾維信生物技術有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

旋風磨：CT410型，福斯賽諾分析儀器蘇州有限公司；

磨粉機：LRMM 8040-3-D型，布勒糧食檢驗儀器無錫有限公司；

粉篩：LFS-30型，布勒糧食檢驗儀器無錫有限公司；

凱氏定氮儀：KJE LTEC2300型，丹麥Foss公司；

紫外可見分光光度計：UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；

和面機：KENWOOD(major classic)型，邑隆貿易(上海)有限公司；

面團成型機：JCXZ型，北京東孚久恒儀器技術有限公司；

電蒸鍋：ZN28YK807-150型，浙江蘇泊爾家電制造有限公司；

質構儀：TA-XT 2i/5型，英國Stable Micro System公司；

多重光散射穩定分析儀(Turbiscan Lab)：Thermo型，法國Formulaction公司；

超高速冷凍離心機：CP100WX型，日本HITACHI公司；

激光共聚焦顯微鏡：LSM 710/780 NLO型，德國卡爾蔡司有限公司；

原子力顯微鏡：Park NX10型，美國斯坦福Park Systems公司；

圖像分析儀(C-Cell)：DYT260型，英國Calibre公司；

LB(Langmuir-Blodgett)膜分析儀：RWYE6型，瑞典Biolin公司。

1.2 方法

1.2.1 全麥粉的制備 小麥籽粒經磨制得麩皮和白面粉。麩皮經130 ℃烘箱2 h，去除內源酶的影響。熱處理后的麩皮經旋風磨粉碎制得80目細麩，按原始比例回添至面粉中制得全麥粉。全麥粉中粗纖維、粗蛋白和戊聚糖含量的測定分別按GB/T 5009.10—2003、GB/T 5009.5—2010、NY/T 2335—2013執行，測定值依次為(2.10±0.01)%，(13.80±0.09)%，(9.58±0.12)%。

1.2.2 全麥饅頭的制備 參考文獻[7]并作適當修改。250 g 全麥粉和1%酵母加入和面機中，加入適量的酶制劑后混合均勻，緩慢加入70%的蒸餾水，加水過程中用筷子攪拌至絮狀。開啟和面機最小檔攪拌約1 min使絮狀面粉形成面團，再開啟和面機至“1”檔，連續和面10 min。將制備好的全麥面團放置到相對濕度85%、溫度34 ℃的發酵箱中發酵40 min。發酵完成的面團分割成4份，每份約70 g，利用面團成型機壓片20次后手工搓圓成5 cm高的面團，再將制成的面團放置到相對濕度85%、溫度34 ℃發酵箱中醒發18 min。醒發完成的面團放置到煮沸的電蒸鍋上蒸煮20 min，取出饅頭放置室溫冷卻1 h，測定其品質特性。酶制劑Pn、Gox添加量分別為60 μg/g(Pn60)和40 μg/g(Gox40)，以及2種添加量的復合(Pn60+Gox40)，并以不添加酶制劑的全麥面團為空白對照組(Control)。

1.2.3 全麥饅頭比容及質構的測定 比容測定參考鄧路璐[8]的方法，采用菜籽置換法測定全麥饅頭的體積。準確稱取饅頭的質量，將饅頭置于圓柱型容器中用菜籽掩埋并搖實，鋪平表面記錄體積，拿出饅頭后記錄此時體積，按式(1)計算比容。

(1)

式中：

c——比容，cm3/g；

V1——圓柱型容器體積，cm3；

V2——拿出饅頭后菜籽總體積，cm3；

m——饅頭的質量，g。

質構測定參考楊煒等[7]的方法。使用電動面包刀切割全麥饅頭成20 mm的薄片，質構儀進行TPA測試。測試參數：探頭P/36R，測前、測試、測后速度均1.00 mm/s，測試距離50%，觸發類型Auto，間隔時間5 s，起點感應力5 g。多次重復試驗，扣除異常數據，取平均值。

1.2.4 全麥饅頭氣孔數的測定 參考白凱旭[9]28-29的方法，采用C-Cell圖像分析儀對全麥饅頭的氣孔數量及結構進行測定。采用電動面包刀將全麥饅頭切片(約10 mm)，取中間2片放置C-Cell圖像分析儀樣品盒中進行拍照測定。

1.2.5 全麥面團水相的制備 按照全麥饅頭制備過程制備出全麥面團，參考Salt等[10]的方法，采用超高速離心分離得到面團水相。取一定量的面團裝滿10 mL PA離心管中，轉子選用P 40 st號，離心力為180 000×g，溫度25 ℃，離心90 min。離心后的第2層液體為面團水相，第1層為油脂漂浮在水相上，吸取第2層的面團水相并棄去上層的油脂及下層的淀粉面筋等。

1.2.6 面團水相成分的測定 水相中蛋白及戊聚糖含量的測定分別按GB/T 5009.5—2010、NY/T 2335—2013執行。

1.2.7 面團水相起泡性質的測定 面團水相泡沫粒徑的測定參考Christian等[11]的方法，利用Turbiscan Lab穩定分析儀來測定。稀釋面團水相8倍，準確移取8 mL的稀釋面團水相置于分析儀配備的測試玻璃瓶中，高速分散器(10 000 r/min)均質1 min后迅速送入分析儀中進行測定。分析儀測定的參數為：多次掃描模式，掃描時間30 min，掃描間隔15 s，樣品室溫度為25，60 ℃，樣品重復試驗2次。

面團水相泡沫穩定性的測定參考Duan等[12]的方法并略微修改。樣品前處理與泡沫粒徑測定相同，將高速分散器均質后的稀釋面團水相迅速轉移到25 mL的量筒中，讀取體積V1，在20 ℃下放置30 min后讀取體積V2，按式(2)計算面團水相泡沫穩定性。

(2)

式中：

W——泡沫穩定性，%；

V1——水相均質后的體積，cm3/g；

V2——均質水相放置30 min后的體積，cm3/g。

1.2.8 面團水相Langmuir-Blodgett(LB)膜的制備 參考李雯露[13]的方法并略微改動，采用Langmuir-Blodgett膜分析儀制備面團水相的LB膜。亞相為蒸餾水，分析儀每次使用前都用無水乙醇清洗完再用超純水沖洗2次。用微量注射器吸取120 μL稀釋120倍的面團水相滴加到水面上，控制擋板壓膜的速度為10 mm/min，Wilhelmy吊片式天平監測膜的表面壓，測量精度0.1 mN/m，以20 mm/min的速度使用垂直提膜法將單分子膜轉移到新云母基片上。

1.2.9 LB膜原子力顯微鏡(AFM)的觀測 采用原子力顯微鏡(AFM)對LB膜的形貌學進行觀察，參考袁春波等[14]的方法并略微改動。在室溫下進行觀測，采用最大掃描線度0.7 μm的掃描頭，力彈性系數0.1 N/m，掃描頻率60 Hz。

1.2.10 LB膜激光共聚焦顯微鏡(CLSM)的觀測 采用蔡司激光共聚焦顯微鏡(CLSM)對LB膜內蛋白與多糖的分布進行觀測，參考McCann等[15]的方法并略微改動。制備0.01% 的異硫氰酸(FITC)和0.01%的羅丹明B染色液分別對多糖和蛋白進行染色。添加2～3滴FITC和羅丹明B染色液到稀釋8倍的面團水相中，1 h后進行LB膜的提拉，在20×0.7的油鏡下進行觀察，FITC的激光激發波長為488 nm，羅丹明B的激光激發波長為543 nm。

1.2.11 數據分析 使用統計軟件Origin 8.0和SPSS 21.0分析數據。單因素方差分析 (One-Way ANOVA)，P<0.05則認為有統計學顯著差異。

2 結果與分析

2.1 酶制劑對全麥饅頭比容及硬度的影響

Shah等[16]研究表明添加Pn能增加全麥面包的比容，其硬度、黏性和咀嚼性發生降低，面包的口感大幅度增加。嚴曉鵬[17]研究顯示添加適量的戊聚糖酶能夠增加面團的延展性，面包的體積也得到顯著增大，面包質構得到改善，面包心更加均勻。劉燕琪等[18]研究表明添加葡萄糖氧化酶(Gox)能增強面團的網絡結構，面團的持氣性、韌性和彈性都顯著增加。Si[19]研究發現面團的乳化效果在添加Gox后顯著增強，面團的持氣性和面包體積都有所增加，能延緩面包的老化。圖1顯示了添加Pn、Gox及Pn-Gox復合下對全麥饅頭比容及硬度的影響，發現添加60 μg/g Pn(Pn60)全麥饅頭的比容增加13.4%，且硬度降低31.7%；添加40 μg/g Gox(Gox40)全麥饅頭的比容增加18.5%，硬度降低42.5%；在復合添加(60 μg/g Pn60+40 μg/g Gox40，Pn60+ Gox40)情況下全麥饅頭的比容增加19.1%，硬度降低48.7%。

不同字母表示有顯著差異(P<0.05)圖1 酶對全麥饅頭比容和硬度的影響

Figure 1 Effect of enzymes on the specific volume and hardness of whole wheat Mantou

2.2 酶制劑對全麥饅頭氣孔結構的影響

表1是C-Cell圖像分析儀對饅頭切片的圖像處理和分析得到的關于饅頭內部氣孔數量及結構等信息。圖2是利用C-Cell圖像分析儀拍下的全麥饅頭內部氣孔結構截面圖，能夠更加清楚地觀察出饅頭內部氣孔的分布情況。切片面積與比容的大小呈正比，表1結果顯示Gox、Pn的添加都顯著增加了切片面積，且復合添加增加最大，這與比容的變化結果一致?？妆诤穸仁潜碚靼l酵制品細膩程度的重要指標，孔壁厚度越低，發酵制品細膩程度越高[9]31，表1結果顯示，添加Pn和Gox均能顯著降低全麥饅頭氣孔的孔壁厚度，表明Pn和Gox的添加均能顯著性提升饅頭的細膩程度，且Gox的提升效果更強。從表1中還看出，添加Pn和Gox均能使饅頭內部氣孔數量增加，氣孔的直徑都顯著降低，且復合添加氣孔數量增加最多達到53.8%，氣孔直徑降低最大達到31.7%。

2.3 酶制劑對全麥面團水相得率及成分的影響

Gan等[20]提出面團氣體分散相和面筋-淀粉網絡間存在薄層液膜結構，Pauly等[21]指出液膜結構對面筋網絡的持氣性和延展性具有很強的修飾作用，在維持面團氣室穩定中發揮重要作用。最新的研究[22]表明，面團水相體系是形成薄層液膜的物質基礎，因此將其作為研究液膜性質的理想材料，并認為面團水相主要由可溶性蛋白、戊聚糖等水溶性物質組成。其中水是構成水相的基體，蛋白等表面活性物質親水親油基團在溶劑中的定向排列是成膜的關鍵，戊聚糖等水溶性組分對確保膜的強度和提高膜的滲透性具有重要作用。表2總結了酶制劑對面團水相得率及其中水溶性蛋白、WEAX

表1 酶制劑對全麥饅頭氣孔數量及結構的影響?Table 1 Effect of enzymes on the structure and quantity of pore in whole wheat Mantou

? 同列標注不同字母表示有顯著差異(P<0.05)。

圖2 全麥饅頭切片氣孔結構截面圖Figure 2 The cross section of pore on whole wheat Mantou slice表2 酶制劑對全麥面團水相得率及成分的影響?

Table 2 Effect of enzymes on the composition and yield of whole wheat dough liquor

樣品得率/%蛋白/(10-2 g·mL-1)WEAX/(10-2 g·mL-1)對照10.90±0.44c2.49±0.10b2.51±0.06bPn6012.20±0.62b2.18±0.11c3.00±0.00aGox4012.96±0.26ab3.18±0.11a2.36±0.06bPn60+Gox4013.30±0.16a2.53±0.04b2.42±0.06b

? 同列標注不同字母表示有顯著差異(P<0.05)。

含量的影響，結果表明添加Pn、Gox均能增加面團水相的得率，且2種酶復合時水相得率最高，增加了22.0%。添加Pn增加水相得率11.9%，這與AX的持水性有關，研究[23]表明Pn能分解WUAX產生小分子WEAX。Pn60的WEAX含量與空白相比增加了19.5%，水相的持水性更強。添加Gox使水相得率增加18.9%，可能是Gox促使了WEAX的氧化凝膠，研究[24]表明WEAX凝膠后的吸水性能提高10～100倍。添加Pn的水相蛋白含量降低了12.4%，這是水相得率增加導致的；添加Gox的水相蛋白含量增高了27.7%，這是因為Gox的氧化作用促使蛋白分子間相互作用形成了大分子量的蛋白。

2.4 酶制劑對全麥面團水相泡沫穩定性的影響

發酵面團屬于特殊“泡沫體系”，面團水相蛋白在薄層液膜氣/液界面上的吸附行為對液膜自身以及面團氣室的穩定性均起到至關重要的作用[21]。根據食品泡沫體系的研究理論，在氣泡形成過程中，具有界面活性的蛋白質分子克服界面壓力和靜電力的作用吸附在兩相界面上形成蛋白吸附層，降低體系的界面張力，維護體系穩定[25]。為探究饅頭在蒸煮過程中升溫對氣室穩定性的影響，研究了在25，60 ℃ 2種溫度下，添加Pn、Gox以及2種酶復合對面團水相泡沫穩定性的影響，結果見圖3。比較圖3相同溫度下不同樣品間泡沫穩定性的差異可知，添加Pn、Gox及2種酶復合均能提高面團水相的穩定性，且60 ℃時加酶對穩定性的提升效果更顯著。添加Pn水相泡沫穩定性增加了63.5%，這是因為WEAX的增加形成更多WEAX-蛋白復合物，研究[25]表明蛋白與多糖能通過氧化膠凝、美拉德反應等化學反應形成蛋白-多糖共價接枝物，以復合物形式吸附于界面。復合物的蛋白質部分可以有效地吸附于界面上降低界面張力，多糖分子鏈在吸附膜的周圍形成立體網狀結構增加膜厚度和機械強度，有利于提高泡沫穩定性；添加Gox水相泡沫穩定性增加了111.5%，這是由于WEAX的氧化凝膠以及蛋白間通過二硫鍵共價交聯在液體界面形成連續黏彈性類似于凝膠的膜[25]。比較圖3同一樣品不同溫度下泡沫穩定性的差異可知，溫度的增加能降低空白和添加Pn的水相泡沫穩定性，可能是隨溫度的升高，膜強度降低，液膜排液速率加快，造成泡沫穩定性下降[26]；對添加Gox和Pn-Gox復合組水相泡沫穩定性有所提升，但不顯著，這是由于添加Gox面團水相黏度的增加[27]使液膜排液速率減慢，穩定性略微增加。

圖4顯示了在25，60 ℃ 2種溫度下，添加Pn、Gox以及2種酶復合對面團水相泡沫泡沫粒徑的影響。研究[6]表明面團液相起泡后，起泡粒徑越大、越不均勻，泡沫穩定性顯著降低，粒徑越大，穩定性越低。由圖4可知，在25 ℃添加Pn-Gox復合酶泡沫粒徑最小，而在60 ℃時添加Pn、Gox和Pn-Gox復合酶均能降低水相泡沫粒徑，且添加Gox的粒徑最小，這一結果與泡沫穩定性的變化一致。面團水相泡沫穩定性的增加和粒徑的降低使饅頭內部氣孔直徑降低，氣孔數量增加，使饅頭更加細膩。

不同小寫字母表示相同溫度下不同樣品間有顯著差異(P<0.05)；不同大寫字母表示同一樣品不同溫度有顯著差異(P<0.05)

圖3 酶對全麥面團水相泡沫穩定性的影響

Figure 3 Effect of enzymes on the foaming stability of whole wheat dough liquor

2.5 全麥面團水相LB膜表面形貌的觀察

Langmuir-Blodgett(LB)膜技術是一種方便穩定的單分子膜制備技術，能把兩親性分子在亞相表面迅速鋪展開形成氣液界面，在氣液界面施加一定的橫向力，分子能在界面上有序排列，形成一層分子排列有序的單分子膜[28]。將新鮮制備面團水相溶液通過Langmuir-Blodgett技術鋪膜，建立薄層液膜氣/液界面模擬體系，通過原子力顯微鏡(AFM)能對氣/液界面膜形貌進行觀察。從圖5中可以發現，與空白相比添加了酶的面團水相LB膜表面分子顯著性增多，分子也顯著性增大，且添加Gox的膜表面分子大小和簇集程度顯著大于其他組，這一結果也證明了水相中大分子蛋白的形成。前文推測添加Pn的面團提取的水相可能有蛋白-多糖復合物的形成，從圖5(b)可以看出膜表面分子較空白組略微增加，該結果能間接證明前文的推測。添加Pn60+Gox40復合酶提取的面團水相LB膜表面分子大小及數量較Pn60有所增加，但少于Gox40，這是多糖對蛋白競爭性吸附，使蛋白分子間相互連接較少導致。

2.6 全麥面團水相LB膜內蛋白多糖分布的觀察

激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)可以從單波長或多波長模式下對多種熒光染組織進行共聚焦熒光數據采集和定量分析，能清楚地形成熒光標記結構的總體圖像，以顯示出目標物質在形態結構上的精確定位。圖6是利用激光共聚焦顯微鏡對全麥面團LB膜內蛋白多糖分布的觀察圖。從圖6(a)可以看出蛋白吸附的界面，密度低，尺寸小。從圖6(b)可以看出LB膜以蛋白為主的界面吸附層，密度有所提高，同時可以看出界面上有較多且大的黃點形成，表明存在多糖-蛋白結合物的形成，且試驗結果顯示Pn促使水相中WEAX含量顯著提高，推測這種多糖-蛋白復合物主要以WEAX-蛋白為主。而有研究[29]表明，添加Pn處理的面團水相中沒有復合物的形成，二者通過非共價作用交聯。Gox及其復合酶形成的蛋白-多糖復合物且尺寸更大，密度更高，證實了Gox和AX的氧化交聯能形成更為致密的界面吸附層。

圖4 酶對全麥面團水相泡沫粒徑的影響Figure 4 Effect of enzymes on the foaming particle size of whole wheat dough liquor

圖5 原子力顯微鏡(AFM)對面團水相LB膜表面形貌觀察圖Figure 5 The surface morphology observation of dough liquor LB film with AFM

紅點表示蛋白的分布情況；綠點表示多糖的分布；黃點為紅點與綠點的重合，是蛋白與多糖結合形成的

圖6 激光共聚焦(CLSM)對面團水相LB膜內多糖蛋白分布觀察圖

Figure 6 The observation of the polysaccharide and protein distributed in dough liquor LB film with CLSM

3 結論

本試驗研究了添加戊聚糖酶(Pn)、葡萄糖氧化酶(Gox)以及2種酶復合對全麥饅頭的改善效果，并且從面團水相層面揭示了Pn和Gox改善饅頭品質的可能原因。發現添加Pn和Gox均能夠使全麥饅頭比容增大，硬度減小，饅頭內部氣孔數量增多，氣孔直徑變小，饅頭更加細膩，且雙酶復合改善效果最好。證實從面團水相理化性質的變化來看，Pn和Gox單一或者協同作用影響了全麥面團體系中的水分分布，面團水相溶液的得率提高，水相溶液中的蛋白和戊聚糖含量發生了顯著的變化，氣泡粒徑大小和穩定性得到了顯著改善，界面蛋白吸附膜質地更為致密。這意味著所形成的氣泡結構在發酵或蒸制過程中抵抗外界應力的能力增加，從而形成較好的內部氣室結構。因此，酶制劑對全麥面團水相溶液性質的調控可能是其改善全麥饅頭品質的重要因素之一。