人附睪蛋白4對上皮性卵巢癌的早期診斷價值

袁　捷，陳　靜

(1.吉安市中醫院婦產科，江西 吉安 343000；2.吉安市白塘街道社區衛生服務中心婦產科，江西 吉安 343000)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)占卵巢癌的60%左右，其發病率和死亡率居女性生殖系統惡性腫瘤的首位[1]。由于EOC早期階段(Ⅰ～Ⅱ期)無典型的臨床表觀，大多數患者確診時已發展至晚期階段，這也是EOC高死亡率的主要原因[2-3]。目前，臨床上對EOC的早期診斷主要借助于常規超聲篩查及血清CA125檢測等手段，但因CA125敏感性和特異性低，導致診斷假陰率較高，聯合超聲檢測陽性診斷率也低于20%[4]。晚期EOC患者5 a死亡率約為早期患者的3倍，高達70%～80%，且EOC的發病率和死亡率正呈逐年上升趨勢[5-6]。因此，越來越多的專家和學者正致力于研究一種高敏感性和特異性的新型EOC早期診斷方法。人附睪蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)可能是一類與精子成熟相關的蛋白酶抑制劑，功能尚不清楚。HE4基因表達與卵巢癌相關，因其可作為EOC診斷的一類特異性腫瘤標志物而引起廣泛重視和研究[3-4]。目前，國內外針對HE4與EOC早期診斷方面的研究主要集中于血清學方面，而關于卵巢組織中特異性表達HE4的研究相對較少。本研究通過檢測患者血清HE4水平，同時結合實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)方法探討卵巢組織中HE4基因表達情況與血清HE4水平之間的關系，這將為HE4在EOC早期診斷中的應用提供實驗依據。

1　資料與方法

1.1一般資料收集我院及江蘇省人民醫院于2013年3月至2016年3月期間經病理學檢查確診為EOC的患者100例(EOC組)，年齡20～69(51.17±12.28)歲；早期(Ⅰ～Ⅱ期)EOC患者44例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)EOC患者56例；組織學類型：漿液性腺癌43例，黏液性腺癌57例；組織分化程度：中、低分化73例，高分化27例。選取同期收治的良性卵巢腫瘤患者35例(良性對照組)和卵巢非腫瘤性疾病患者30例(正常對照組)。良性對照組患者年齡23～68(52.52±14.25)歲。正常對照組患者年齡24～63(51.25±15.27)歲。收集患者年齡、FIGO分期、組織分化程度和淋巴結轉移等臨床病理資料，其中部分EOC患者和卵巢非腫瘤性疾病患者信息樣本由江蘇省人民醫院收集。其中正常對照組標本取自絕經宮頸癌患者手術治療同期切除的正常卵巢組織，良性對照組標本取自卵巢囊腫和肌瘤患者手術切除的良性卵巢腫瘤組織。入組患者排除重癥內科疾病，既往無其他惡性腫瘤史，首次治療切除卵巢組織前均未接受放療或化療。

1.2實驗試劑與儀器HE4定量檢測試劑盒(電化學發光法)和全自動免疫分析儀均購自德國Roch公司。RNA提取試劑盒購自美國Promega公司，上下游引物由美國Invitrogen公司合成，一步法qPCR試劑盒和Smart SpecTMPlus核酸蛋白測定儀均購自美國Bio-Rad公司。高速組織勻漿機購自德國IKA公司。Step One PlusTM實時熒光定量PCR系統購自美國ABI公司。

1.3電化學發光法檢測血清HE4水平所有患者于住院治療期間進行空腹靜脈采血，血液樣本在4 h內離心分離，收集血清放于-80 ℃冰箱保存。行化學發光前，所有樣本低溫解凍，并按檢測試劑盒和儀器操作步驟進行。樣本溶解后于4 ℃低溫保藏，并于48 h內進行檢測。HE4的電化學發光檢測項目參考范圍為0～140 pmol·L-1，>140 pmol·L-1則記為陽性。

1.4qPCR檢測HE4mRNA表達卵巢組織經高速組織勻漿機低溫勻漿并提取組織RNA，應用核酸定量儀定量后控制RNA濃度在2.0 μg·L-1。一步法qPCR擴增體系配制如下：RNA模板2 μL，上下游引物各0.4 μL，2×SYBR?Green Mix 10 μL，iScript逆轉錄酶0.25 μL，無核酶水6.95 μL，總體系為20 μL。程序設定如下：50 ℃，10 min行逆轉錄反應，95 ℃，60 s預變性；95 ℃，15 s變性，60 ℃，60 s退火，共36個循環。溶解曲線程序采用儀器默認設置，數據處理方法采用2-ΔΔCT相對定量法。

2　結果

2.1各組患者血清HE4陽性率比較各組患者血清HE4陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)。正常對照組、良性對照組和EOC組患者血清HE4陽性率分別為0.00%(0/30)、17.14%(6/35)和75.00%(75/100)，EOC組的陽性率明顯高于正常對照組和良性對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1　各組患者血清HE4陽性率比較

2.2EOC患者血清HE4陽性率與臨床病理參數的關系晚期患者HE4陽性率顯著高于早期患者(P<0.05)。中、低分化患者HE4陽性率顯著高于高分化患者(P<0.05)。有淋巴結轉移患者HE4陽性率明顯高于無淋巴結轉移患者(P<0.05)。見表2。

表2　EOC患者血清HE4陽性率與臨床病理參數的關系

2.3各組患者卵巢組織中HE4mRNA的表達情況比較各組患者卵巢組織中HE4 mRNA的表達比較差異有統計學意義(P<0.05)。EOC組患者卵巢組織中HE4 mRNA表達水平明顯高于正常對照組和良性對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3　各組患者卵巢組織中HE4 mRNA表達的比較

2.4EOC患者卵巢組織中HE4mRNA的表達與臨床病理參數的關系與早期患者相比，晚期患者卵巢組織中HE4 mRNA表達明顯上調(P<0.05)。中、低分化患者HE4 mRNA水平顯著高于高分化患者(P<0.05)。同時，淋巴結轉移的患者HE4 mRNA水平也均高于無淋巴結轉移患者(P<0.05)。但卵巢組織中HE4 mRNA的表達均與患者年齡和組織分型無關(P>0.05)。見表4。

表4　EOC患者卵巢組織中HE4 mRNA的表達與臨床病理參數的關系

3　討論

目前，臨床上常規借助CA125聯合超聲篩查等手段用于EOC早期診斷，但CA125存在敏感性差和組織特異性低等制約因素[4]。研究[4]顯示，在EOC患者中，約20%的群體不表達或低表達CA125，且我院往期收治患者中也出現部分CA125假陽性結果，往往因患者存在個體差異及良性腫瘤等影響因素，導致常規診斷手段的EOC診斷率較低。本文所研究的HE4是一類與生殖相關的蛋白酶抑制劑類物質，其本質上是一種分泌型糖蛋白，但生物學功能目前尚不清楚[7-8]。已有研究[9]證實HE4與卵巢癌病理生理過程相關。本研究檢測患者血清中的HE4水平后發現，EOC患者血清中HE4陽性率顯著高于良性對照組和正常對照組，表明EOC患者體內高表達和分泌HE4。尤其在正常對照組中無HE4陽性患者，良性對照組HE4陽性率也未超過20%，這進一步提示患者血清中HE4水平變化可能與卵巢組織癌變有關。

由于HE4是一種分泌型糖蛋白，不利于組織原位檢測[7-8]。因此，為了進一步探討患者血清HE4水平與卵巢癌變之間的可能性關系，本研究利用qPCR方法檢測了3組患者卵巢組織中HE4 mRNA的表達變化，結果顯示EOC患者卵巢組織中HE4 mRNA的表達顯著高于卵巢良性腫瘤和正常卵巢組織，表明卵巢癌變可引起組織中HE4 mRNA表達上調，這也與HE4在卵巢癌細胞系中高表達的研究結果相一致[10]。有研究[11]顯示，HE4在人體正常卵巢組織中不表達或低表達，結合血清HE4檢測結果，進一步提示卵巢癌變導致組織中的HE4 mRNA表達上調，可能進一步促進了HE4蛋白的合成和分泌過程。

從EOC患者血清HE4水平和mRNA檢測結果與臨床病理參數的關系可以看出，以上HE4檢測指標均與臨床分期、細胞分化程度及淋巴結轉移情況顯著相關，這進一步說明HE4在EOC的發生與發展過程中扮演一定的角色。同時，HE4具有較強的組織特異性，可彌補常規CA125篩查導致的假陰性較高缺陷，因此推測HE4檢測指標可用于EOC的篩查和診斷。

本研究結合qPCR等分子生物學方法，探討了血清HE4與卵巢組織中HE4基因表達的可能性關系，這為研究HE4在EOC組織中特異性表達及血清HE4檢測指標用于EOC的早期診斷等方面提供了實驗依據。