商業化腐乳中乳酸菌的分離與鑒定

□ 張志超 湯臣倍健股份有限公司 羅劍鳴 暨南大學 殷光玲 湯臣倍健股份有限公司

腐乳（Sufu）是一種源自中國的傳統發酵大豆食品，以絮凝后的豆漿為底物經多種微生物混合發酵而成的植物奶酪狀食品，可佐餐，亦可調味。在腐乳生產期間，前期發酵主要為生產菌株在豆腐坯繁殖和發酵，此時豆腐蛋白分解，淀粉糖化。后期發酵主要為酶與微生物的協同發酵，大豆蛋白被分解為低分子肽和必需氨基酸[1]，同時伴隨酯類、有機酸和醇類的生成[2]，共同形成腐乳特有的香味和色澤。雖然目前腐乳的商業化生產正朝著機械化的方向發展[3]，比如前期發酵使用純菌接種發酵代替自然發酵，之后直接裝瓶進行后期發酵，但是目前仍以傳統工藝為主，傳統生產中仍然存在發酵周期長、影響因素多、生產效率低、安全隱患大等缺點[4]。豆腐坯在前期接種純菌后，會置于敞開的自然條件下進行培養發酵，外加發酵時間比較長（3～6個月），難免會有各種微生物生長，給產品的品質、食用安全性帶來潛在風險。

乳酸菌廣泛存在于各類發酵大豆制品中，乳酸菌作為一類能夠發酵糖大量生產乳酸的革蘭氏陽性細菌，其代謝產物不僅影響產品的色澤、風味和品質，并且能夠抑制腐敗微生物，延長保質期。有研究表明，從特定發酵食品中分離鑒定出的乳酸菌可以被認為是該食品進行發酵的最佳發酵菌株，并且比其他來源的乳酸菌具有更強的適應力和競爭力。本文對市售占比較高的10種腐乳進行選擇性分離，并對篩目標菌株進行基因分子鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

腐乳（白方、青方、紅方）：樣品購于各大超市，均在保質期內，于室溫下保存。MRS培養基，購于廣東環凱微生物科技有限公司；納他霉素，購于丹尼斯克。

細菌基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型），購于TIANGEN天根生化科技（北京）有限公司；溴化乙錠（EB），TE 緩沖液，5 × TBE電泳緩沖液蛋白酶K，Lyticase，dNTP，10 × PCR Buffer，Loading Buffer，r -Taq 酶，購于上海生工有限公司。引物及其他酶制劑由英濰捷基生物技術有限公司合成提供。

1.2 儀器與設備

WS- CJ- 1F 型雙面單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；電子天平（XB120A），沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；便攜式pH 計（Mettler Toledo S20K pH meter） 梅 特 勒 -托利多儀器（上海）有限公司；Thermo CO2培養恒溫培養箱，Thermo 公司；Bio-RAD C100TM Thermal cycler PCR 儀（Bio-Rad，Hercules， CA， USA） ，美國ABI公司； 凝膠成像系統（Tanon 2500），中國天能公司；Sub- Cell GT BASIC 型電泳儀，意大利Bio- Rad 公司離心機（5804R），德國Eppendorf公司；手提式壓力蒸汽滅菌器（SYQDXS-280A），上海申安醫療器械廠PL602- S 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品計數與分離純化

取2g腐乳樣品，溶解于18mL去離子水中，均質機均質30s后，作為10-1備用。

制備樣品梯度稀釋液→每個稀釋梯度各取100 μL 涂布于添加納他霉素的MRS 培養基→37 ℃厭氧倒置培養→ 挑取不同形態的菌落→通過平板劃線分離法反復分離純化→顯微鏡下進行形態鑒定→在MRS 液體培養基中增殖培養→甘油管冷凍保存。

1.3.2 16S rDNA序列分析與鑒定

將以上MRS肉湯培養物按照TIANGEN公司的細菌基因組DNA的提取操作說明，將提取到的各細菌基因組DNA為模板，利用細菌16S rDNA引物，進行特異性PCR反應。PCR擴增反應完畢后，利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。將有目標片段的PCR反應產物用DNA測序儀進行16S rDNA序列分析，分析結果與GenBank中的基因序列進行BLAST同源性比對分析，以序列同源性大于99%為標準進行菌種歸類。

50 μL PCR擴增反應體系：去離子雙蒸水 33.7 μL，5×PCR buffer 10 μL，2.5mM dNTP buffer 4 μL，上下游引物共2 μL，GoTaq DNA 酶 0.3 μL。

PCR擴增引物：正向引物為27F :5’-AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’；反向引物為1319R: 5’- ACGGGCGGTGTGTAC-3’。

PCR擴增反應程序為：95 ℃預變性5min；95 ℃變性1 min，60℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環35 次；72℃延伸5 min，4 ℃保溫。

2 結果與討論

2.1 腐乳樣品中乳酸菌的分離

使用MRS培養基從樣品中分離LAB，但由于菌落發酵過程中微生物的多樣性，每個樣品都呈現出不同形態的菌落以及菌落數量（表1）。通過顯微鏡下觀察細菌形態，去除霉菌、酵母形態的菌落，共選擇162株球狀或桿狀菌株進行鑒定。各個樣品所選擇的進行鑒定的菌落數量見表1。

培養2 d后，所有樣品中的菌落總數從1.2E + 02至1.5E + 04，不同樣品之間差異較小。 但在培養到7 d時，FR01、FR03、FR05、FR07、FR08 出現小菌落，FR07樣品中小菌落數量最高（7.584Log CFU/g）。

表1 MRS培養基上分離、純化出的疑似菌株

表2 分離自腐乳樣品中162株16S rDNA序列鑒定結果

2.2 篩選菌株16S rDNA序列鑒定結果

從以上方法中分離純化得到的162株菌通過基因組16S rDNA 序列鑒定，鑒定結果見表2。

不同的腐乳樣品中菌落種類差異較大。MRS培養基中篩選出的菌株大約90%為革蘭氏陽性菌，因為革蘭氏陽性菌對鹽和乙醇的耐受性相對強于革蘭氏陰性菌[5]。FR04樣品在MRS肉湯中沒有生長，這可能是因為樣品生長環境與MRS培養液不同導致。乳酸菌 屬 從 FR02、FR03、FR06、FR07、FR08共5個腐乳樣品中分離出來，FR02、FR03均為植物乳桿菌（L.plantarum），這與魯緋等[6]從青方腐乳中分離得到植物乳桿菌結果相一致。FR06樣品中篩選鑒定出較多數量的嗜酸乳桿菌（L.acidipiscis），而來自FR07、FR08樣品中的小菌落鑒定為嗜鹽乳桿菌（L.halophilus），這種嗜鹽細菌在鹽濃度正常的MRS培養基中存在緩慢生長現象，有文獻表明在許多品牌的腐乳中都能發現比較高數量級的嗜鹽乳酸菌[7]。

芽 孢 桿 菌 屬 在 FR03、FR05、FR06、FR07、FR08、FR09和 FR10共7個樣品中有檢測到，比乳桿菌屬占比更高。其中包括凝結芽孢桿菌（B.coaqulans），蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、人參土芽孢桿菌（ B.qinssengihumi）和枯草芽孢桿菌（B. subtili）。10個腐乳樣品中共有5個樣品分離出蠟樣芽孢桿菌，通常被學者認為其在食物中的含量超過105CFU/g（mL）時就有可能帶來中毒癥狀，而蠟樣芽孢桿菌產生的腸毒素容易導致一些食源性疾病的產生[8]，有文獻指出，蠟樣芽孢桿菌污染腐乳的主要中間產品為酸漿水、種水和鹽水[9]。僅在菌株多樣化程度最高的FR07樣品中檢測到腸球菌屬屎腸球菌（E.faecium），有研究表明，大多數腸桿菌科不耐受鹽濃度升高[10]，所以以上樣品中均未檢測到腸桿菌科。

3 結論

不同來源的腐乳的細菌組成差異很大，表明不同腐乳生產地區的微生物差異很大，這可能是因為制作程序，發酵菌株與生產廠家環境的差異，這一點也在文獻研究中被證實[8]。從10種市售腐乳中共分離得到4種乳酸菌，經16S rDNA鑒定，分別為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜鹽乳酸菌以及乳桿菌Akporo7 ，為乳酸菌應用在商業化腐乳發酵，抑制腐敗微生物提供研究支持。