Meleda角化病一家系的SLURP1基因突變研究并文獻回顧

徐 哲，林志淼

Meleda角化?。╩al de Meleda，OMIM 248390）是一種罕見的常染色體隱性遺傳的掌跖角化?。╬almoplantar keratoderma，PPK），又被稱為Meleda病，由Luca Stulli首次發現于地中海東部的現屬于克羅地亞的Melada島。1898年，Neumann首次在文獻中報道了本病[1]，患病率約1/10萬[2]。臨床表現為掌跖部位的彌漫角化增生性斑塊，手足背側和肘膝部等四肢伸側亦可受累?；颊呱蟛痪冒l病，表現為界限分明的掌跖角化伴炎癥反應，有異味。常見的特征還包括多汗、口周紅斑、關節處苔蘚樣角化性斑塊、錐形指、短指以及指甲肥厚畸形等。其致病基因為位于8q24.3的SLURP1基因[3]，編碼分泌型尿激酶型纖溶酶原-LY6 /哺乳動物受體相關蛋白1（SLURP1）。SLURP1蛋白是Ly-6蛋白超家族的一個成員，其典型特征是10個半胱氨酸殘基之間的二硫鍵結構以及類似蛇毒素的CCX4CN結構域。SLURP1是α-7-煙堿型乙酰膽堿受體的內源性配體，作為神經調節因子可調節表皮穩態以及腫瘤壞死因子介導的炎癥反應[3]。本研究收集到一個Meleda角化病家系，對家系中的成年男性患者、其父母和配偶等人，在獲得遺傳學研究的知情同意后，進行了基因突變分析。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

圖1 Meleda角化病患者皮損

先證者，男，29歲。因出生時即出現掌跖部位紅斑、脫屑，并逐漸擴展加重，累及手足背和肘膝部等，伴隨皮膚多汗、皸裂和瘙癢，偶爾出現趾縫間真菌感染而就診。1歲10月齡時，足背及肘膝部紅斑發展為淡紅色角化性略隆起的斑塊，表面粗糙，有少量角化性鱗屑。手足多汗明顯，有腥臭氣味，略瘙癢。至3歲齡時，皮損累及到口周、鼻周及臀部，口周和鼻周無明顯痛癢等不適。父母體健，非近親結婚，家族中未見有相似癥狀的親屬。體格檢查：全身各系統體檢未見明顯異常。皮膚科情況：雙側手掌和足跖對稱分布角化性淡黃色斑塊，增厚明顯，有皸裂伴惡臭，甲板略均勻增厚。皮損延伸至手足背部，跨過掌指（趾）關節直至手足背遠端的2/3處，與正常皮膚邊界清晰，足縫見白色浸漬（圖1a-1c），指（趾）活動不受限。肘、膝伸側見對稱分布的角化性斑塊。雙側鼻翼及口周對稱性紅斑，右側鼻翼處見刺樣凸起（圖1d）；肛周及會陰部對稱性邊界清晰的淡黃色角化性斑片，外緣距肛門中心6 cm左右（圖1e）。肘部皮損組織病理檢查：表皮角化過度，顆粒層增厚，棘層肥厚，可見少量角化不全伴銀屑病樣增生，真皮乳頭延長。真皮上部毛細血管擴張，血管周圍稀疏以淋巴細胞為主的炎性浸潤（圖2）。手足真菌鏡檢陰性。根據患者自幼出現皮損，進行性加重，表現為累及掌跖及手足背、肘膝部等的角化性斑塊，結合組織病理改變，診斷為Meleda角化病。采用5%水楊酸軟膏外用2周，脫屑減少，皮損角化增生未見明顯好轉。

1.2 方法

圖2 Meleda角化病患者肘部皮損組織病理（HE染色×100）

1.2.1 外周血DNA提取 抽取患者及其父母以及配偶共4人外周血各2 ml，另100例健康人外周血作為對照，血液標本2%EDTA抗凝?；颊呒捌浼覍俸炇鹬橥鈺?，采用QIAGEN 全血基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN，德國），按照說明書標準流程提取基因組DNA。使用NanoDrop2000C超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）進行DNA濃度及純度測定。

1.2.2 聚合酶鏈反應（PCR）引物設計及SLURP1基因的DNA序列擴增 根據GenBank數據庫中基因SLURP1的DNA序列（NC_000008.11）及PCR引物設計原則，采用軟件Primer Premier 6.0設計特異性引物，共3對。交由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見表1。PCR擴增體系25 μl，反應體系中包括2×LA Taq Premix（Takara，日本）12.5 μl,10 μmol/L上下游引物各1 μl，基因組DNA模板1 μl（50～ 500 ng/μl）。PCR 反應條件為 94 ℃預變性 3 min ；94 ℃ 30 s，退火 30 s，72 ℃ 60 s，30 個循環 ；72 ℃延伸 7 min。

1.2.3 擴增產物測序分析純化后的PCR產物擴增產物送上海美吉生物醫藥科技有限公司，采用熒光標記雙脫氧末端法在ABI PRISM 3730XL（Applied Biosystems，美國）測序儀上進行測序。應用Chromas軟件進行序列讀取分析，其結果運用BLAST軟件與標準SLURP1序列（NM_020427）進行比對分析。

2 結果

2.1 SLURP1基因突變

在患者SLURP1基因第3外顯子檢測到純合突變c.256G＞A，該突變導致所編碼蛋白的的第86位氨基酸由甘氨酸變為精氨酸（p.G86R）（圖3b）。

表1 SLURP1引物序列

圖3 SLURP1基因突變測序圖

2.2 突變來源分析

在患者父母檢測到SLURP1基因第3外顯子的雜合突變c.256G＞A（圖3c,3d），符合常染色體隱性遺傳的致病模式?；颊吲渑糞LURP1基因測序未發現異常。

3 討論

Meleda角化病是一種罕見的常染色體隱性遺傳的掌跖角化病，臨床表現為彌漫性掌跖角化增厚，逐漸累及手足背側及肘膝部。皮膚角化性紅斑分布于口周、關節、肛周等處。常見因手足多汗和繼發感染引起惡臭以及指（趾）縫浸漬。皮損進展可導致嚴重的功能障礙，影響手、足活動，甚至出現自發的手足指（趾）假性斷指畸形。掌跖皮損其他特征還包括苔蘚樣病變、短指、甲板畸形和甲營養不良等，該病嚴重影響患者的生活質量。自從19世紀該病被首次發現以來，至少在19個國家地區相繼報道，包括阿爾及利亞，智利，中國，德國，印度，印度尼西亞，意大利，日本，韓國，老撾，利比亞，荷蘭，巴基斯坦，阿拉伯，蘇格蘭，瑞典，突尼斯，土耳其和阿拉伯聯合酋長國等[4-9]。本病呈隱性遺傳模式，因此具有家族史常常能為診斷提供證據，散發病例相對更少。國內該病少見報道，僅Zhang等[10]首次報道在兩個家系中發現3例患兒。王艷等[11]報道1例X連鎖魚鱗病并發Melada角化病患兒，本病例為國內報道的第3例Melada角化病。

Meleda角化病的組織病理表現為表皮彌漫性角質層增生和棘層增厚，但不伴有棘層松解。某些患者可以在組織病理學方面將其作為與表皮松解性魚鱗?。╡pidermolyticichthyosis，EI） 等 其他基因相關的角化性疾病的不同之處相鑒別[12]。表皮松解性角化過度是一種組織學模式，可見于一些類型的掌跖角化癥、EI或表皮松解性棘皮瘤等皮膚病，主要特點是致密的角化過度，表皮上部棘層松解所致的裂隙或水皰，可見棘層松解細胞等。本病其他的組織病理表現為偶爾可見角化不全及真皮淺層少量炎性細胞浸潤等。目前有包括彌漫性PPK、彌漫性殘毀性PPK、外胚葉發育不良伴PPK等超過25種掌跖呈角化性皮損的PPK，但需要與Meleda角化病相鑒別的主要是殘毀性皮膚角化?。ㄓ址QOlmsted綜合征）和長島型掌跖角化病[9]。前者呈常染色體顯性遺傳，臨床表現為累及口周及掌跖的紅斑和角化，皮損極為嚴重，在兒童期就可以發生斷指等癥狀，脫發和劇烈瘙癢也是其典型特征；長島型掌跖角化病主要表現為掌跖部位均勻增厚的紅斑角化，伴有遇水后掌跖發白、腫脹和手足多汗，皮損不隨年齡增長而加重，通?？谥艿炔课徊皇芾?。

Meleda角化病為編碼SLURP1蛋白的基因SLURP1突變所致。SLURP1位于8q24.3，由3個外顯子組成。SLURP1蛋白是分泌型Ly-6/uPar蛋白超家族中的一員，含有3個結構域，5個雙硫鍵，廣泛分布于人體皮膚，尤其是掌跖的角質形成細胞，可以提高煙堿型乙酰膽堿a7受體在表皮角質形成細胞中激活凋亡、誘導分化的作用[13]，參與調節角質形成細胞的生長、增殖。當SLURP1基因突變失活時，由于角質形成細胞凋亡異常，導致皮膚高度角化，同時由于SLURP1具有抑制巨噬細胞和角質形成細胞釋放腫瘤壞死因子α的功能，SLURP1失活是引起長期炎癥反應的誘因[13]。目前，全世界已檢測到16個SLURP1基因的突變位點[10]，此前中國大陸人群中僅檢測到3例患者以及1例X連鎖魚鱗病并發Melada角化病患者的SLURP1突變。其中在兩個無關家系均檢測到c.256G＞A的突變[10]，王艷等[11]在X連鎖魚鱗病并發Melada角化病患者檢測到c.286C＞T的突變，患者均為純合突變。本研究中患者所檢測到的突變為c.256G＞A純合突變，突變來自于雜合的父母攜帶者，但是父母之間的近親關系未知。該突變與之前在中國大陸發現的突變一致，p.G86R也曾在韓國，中國臺灣以及中東等地區的患者中發現[10,14]，提示突變熱點的存在。既往認為Meleda角化病在Meleda島以及中東和地中海地區發病率較高，原因是這些地區，特別是海島城市中近親婚配常見，血緣關系較近，提示存在祖先效應。突變所在的第86位甘氨酸位于高度保守結構域，變為精氨酸后可能通過改變蛋白結構，影響表皮穩態以及免疫功能的調節，進而引起患者臨床表現。

本研究在一個Meleda角化病家系中檢測到成年男性SLURP1基因的純合錯義突變c.256G＞A（p.G86R），該突變在國外曾被報道，國內為第2次報道。既往中國大陸首次報道的3例患者均為年齡較小的患兒（2歲、4歲和11歲）[10]。本文患者突變來自于雜合的父母攜帶者，從基因水平上證實了臨床診斷，同時豐富了Meleda角化病的中國患者組成譜。由于患者配偶不攜帶突變，所以患者所生育的后代為攜帶者，為其遺傳咨詢提供了依據。以皮膚角化增生性皮損為主的魚鱗病、汗孔角化癥和PPK等皮膚病，目前主要的治療方法以潤膚、角質剝脫和恢復皮膚屏障功能為主，嚴重者可以選擇口服維A酸類藥物[15]。該例患者拒絕選擇口服藥物治療，目前治療僅以外用水楊酸制劑為主，效果不明顯。雖然研究顯示腫瘤壞死因子α在Meleda角化病炎癥方面起著重要作用[9]，但是找不到任何關于應用生物或其他免疫調節劑治療這種掌跖角化性疾病的報道。隨著精準醫學時代的到來，生物制劑有可能應用于治療Meleda角化病等角化性疾病。