雛菊葉龍膽酮對低氧誘導PC12細胞的保護作用及潛在機制

趙志英 高洋洋 高玉娟 高 黎 張 明 姜寒薇

(包頭醫學院麻醉學院，內蒙古 包頭 014040)

缺血/低氧腦損傷是各種腦血管病發生發展形成的病理基礎，缺血/低氧將直接引起腦損傷并導致級聯病理生理損傷效應〔1〕。引起缺血腦損傷的主要機制之一是細胞凋亡，抑制神經細胞凋亡可減輕腦缺血損傷。尖葉假龍膽提取物具有保肝、抗氧化、抗感染、抗腫瘤等藥理作用〔2〕。雛菊葉龍膽酮(Bellidifolin)是從龍膽科植物中分離提取的口山酮(Xanthones)類化合物，在植物中含量很高，且性質穩定。高黎等〔3〕發現，Bellidifolin對缺血性大鼠腦損傷，特別是局灶性腦缺血損傷具有顯著的保護作用，且其保護作用的機制可能與抑制氧化應激，降低興奮性氨基酸水平和增加γ-氨基丁酸(GABA)含量有關。也有研究發現Bellidifolin增加了睫狀神經營養因子(CNTF)的釋放，促進了坐骨神經損傷后的恢復功能〔3，4〕。細胞凋亡是多重信號分子的級聯反應，在凋亡的啟動和執行過程中需要某些蛋白、蛋白酶的參與。研究證明半胱天冬酶(Caspase)依賴性通路和非Caspase 依賴性通路于細胞凋亡時發揮重要作用〔5〕。其中Caspase-3是Caspase級聯反應的最終執行者〔6〕，多種刺激因素啟動的凋亡信號激活Caspase-3，切割下游的核酸酶、細胞骨架、蛋白激酶等，通過使細胞重要蛋白質降解失活，引起細胞形態改變導致細胞凋亡。有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路被各種細胞外信號激活，隨后被磷酸化，涉及一系列生理和病理過程，包括細胞周期調控，細胞增殖和凋亡〔7〕。有研究認為細胞外信號調節激酶(ERK)通路激活主要是促進細胞存活和抑制凋亡，而JNK和p38MAPK通路的激活主要與細胞凋亡有關〔8，9〕。本文擬分析Bellidifolin對缺氧誘導神經元損傷的保護作用及潛在機制。

1 材料和方法

1.1材料 Bellidifolin(純度>98%)購自四川維克奇生物科技有限公司。大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC12)購于中國科學院上海細胞所。DMEM、RIPA裂解液和馬血清購自美國Gibco公司。二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒購自福州邁新生物，兔抗p38MAPK、pERK、β-actin及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自美國Santa公司，其他試劑均購自美國Sigma公司。

1.2PC12培養及低氧模型制備 PC12培養于含5%馬血清，5%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃含有5%CO2的細胞培養箱中貼壁培養。隔天換液，待進入對數生長期后用于后續實驗。細胞分為未處理的對照組、低氧模型組、低、中、高劑量組(細胞用10、20、40 μmol/L Bellidifolin處理后低氧4 h，細胞放置在37℃孵育箱進行低氧刺激)。低氧刺激條件：低氧(1%O2、5%CO2、94%N2)6 h和常氧(21%O2、5%CO2、74%N2)8 h。

1.3細胞活力檢測 取PC12，用DMEM培養液配成1×105/ml的細胞懸液，接種于96孔板中，培養24 h，用不同濃度Bellidifolin(10、20、40 μmol/L)作用6 h后，低氧模型組和各給藥組給予低氧刺激，培養24 h后用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測細胞活性。測定570 nm處的吸光值，計算細胞存活率，每組設3個平行孔。

1.4Western印跡法檢測Caspase-3蛋白表達 每組細胞收集后加入RIPA裂解液，用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離裂解物(20 μg蛋白質)并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉4℃封閉，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入一抗孵育過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G為第二抗體，室溫孵育1 h，電化學發光法(ECL)顯色，以β-Actin為內參，放入暗盒壓片1 min后顯影，定影。通過凝膠成像系統，進行蛋白表達量的半定量分析。

1.5免疫組織化學染色檢測MAPK信號通路兩種調控蛋白表達 取PC12爬片，按常規方法用4%多聚甲醛固定，進行免疫組織化學染色。免疫組化采用ENVISION二步法，正常山羊血清封閉，一抗4℃過夜(pERK抗體濃度為1∶200，p-p38MAPK抗體濃度為1∶500)。DAB顯色液顯色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片?？瞻讓φ涨衅粤姿猁}緩沖液(PBS)代替一抗。應用Image-pro plus5.0圖像分析系統對免疫細胞化學染色陽性細胞進行OD值的測量。

1.6統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1Bellidifolin對低氧PC12的影響 倒置熒光顯微鏡下見對照組PC12生長旺盛，多呈圓形或不規則形，胞核較大，胞體飽滿、偶有扁平而長的突起，貼壁好。低氧模型組細胞結構破壞，表現為細胞貼壁性差，胞體皺縮，見大量細胞碎片和漂浮死細胞；而用不同濃度Bellidifolin作用6 h后，再進行低氧刺激，不同程度破壞了細胞形態，低劑量組破壞最嚴重，高劑量組細胞破壞最輕。見圖1。

圖1 5組細胞形態變化(×40)

2.2細胞存活率檢測 低氧模型組PC12存活率(42.07%±2.97%)明顯低于對照組(96.19%±2.41%，P<0.05)。與對照組相比，預先用不同濃度Bellidifolin作用6 h后，再進行低氧刺激，PC12損傷減輕，細胞存活率明顯提高(P<0.05)，其中中、高劑量組細胞存活率(70.28%±4.00%，85.30%±2.45%)與低氧模型組、低劑量組(45.62%±4.83%)差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3Bellidifolin對低氧誘導PC12 pERK蛋白表達的影響 PC12經低氧處理后，pERK蛋白表達(OD值：7.31±0.65)略有降低，與對照組(7.74±0.41)及低、中、高劑量組(7.43±0.66、7.54±0.58，7.83±0.71)比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4Bellidifolin對低氧誘導PC12細胞p-p38MAPK蛋白表達的影響 與對照組(OD值：4.66±0.49)比較，PC12經低氧刺激6 h后，p-p38MAPK蛋白表達(7.46±0.52)顯著增強(P<0.05)。預先用不同濃度Bellidifolin作用6 h后，再進行低氧刺激，PC12 p-p38MAPK蛋白表達顯著降低(P<0.05)，其中中、高劑量組p-p38MAPK蛋白表達(5.70±0.40、5.37±0.37)與低氧模型組、低劑量組(7.32±0.42)差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 免疫組織化學檢測各組細胞p-p38MAPK表達(×100)

2.5Bellidifolin對低氧誘導PC12 MAPK信號通路下游產物Caspase-3蛋白表達的影響 與對照組(1.00±0.06)比較，經低氧刺激6 h后，可引起MAPK信號通路下游凋亡關鍵因子Caspase-3在PC12中的表達(2.96±0.34)顯著升高(P<0.05)。預先用不同濃度Bellidifolin作用6 h后，再進行低氧刺激，PC12 Caspase-3表達顯著降低(P<0.05)，Caspase-3表達隨著Bellidifolin濃度的增大逐步降低(P<0.05)，低、中、高劑量組分別為1.96±0.46、1.49±0.37、0.99±0.20，見圖3。

圖3 Western印跡檢測各組細胞Caspase-3表達

3 討 論

缺血性腦血管疾病均可導致不同程度的腦神經細胞缺血/缺氧。腦缺血/低氧損傷是引起中樞神經元凋亡的起始因素，其與腦血管痙攣、腦動脈硬化、血栓形成和出血有關〔10，11〕。低氧對大腦的直接損傷是各種腦血管疾病的始動環節。MAPK在神經系統疾病的發病機制中，對神經細胞的氧化應激反應、細胞存活起到關鍵性作用，通過連續的磷酸化調節信號分子把外部環境信號轉導到細胞核及其他細胞內靶點，調控細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞生物功能關鍵細胞信號轉導通路〔12〕。在缺血/低氧條件下，線粒體通透性轉變孔打開，促凋亡蛋白釋放，并激活Caspase級聯反應來觸發細胞凋亡〔13〕。MAPK與缺氧/復氧(H/R)損傷密切相關，低氧提高p-p38MAPK及MAPK信號傳導通路關鍵凋亡因子Caspase-3蛋白表達〔14〕。本研究證明低氧可導致PC12損傷，同時可降低細胞p38MAPK和Caspase-3蛋白表達。

細胞形態學變化表明，Bellidifolin對PC12低氧模型發揮了有利作用。40 μmol/L Bellidifolin預處理，再低氧刺激后，PC12形態破壞明顯減輕，幾乎完整，細胞數量增加。Bellidifolin具有濃度依賴性，兩個較低濃度不能有效預防低氧導致的損傷。細胞存活率的數據再次證實，高濃度的Bellidifolin能夠提高細胞存活率。本研究進一步發現，pERK通路不參與細胞低氧引起的細胞凋亡，但低氧引起p38MAPK蛋白質表達顯著增加，p38MAPK通路參與細胞低氧引起的細胞凋亡，與Cui等〔14〕研究結果一致。說明Bellidifolin對抗低氧所致PC12損傷的能力與其降低p38MAPK和Caspase-3蛋白表達有關。Bellidifolin具有濃度依賴性，只有最高提取物量能有效恢復細胞活力、細胞形態和代謝控制水平。

綜上，Bellidifolin可有效抑制低氧所致的PC12凋亡，其機制可能與抑制p38MAPK信號通路的活化及下游Caspase-3的表達有關。