馬鈴薯根系分泌物組分對不同種植模式的響應

譚雪蓮，郭天文，馬明生，張平良

(甘肅省農業科學院旱地農業研究所，甘肅省水資源高效利用重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是我國第四大糧食作物，已成為貧困邊遠地區農民脫貧致富和增加收入的重要產業。隨著馬鈴薯產業的快速發展和種植效益的不斷提高，連作障礙問題日益凸顯，出現了諸如土壤微生態環境惡化，有害微生物種群增加，病蟲害加劇，土壤養分失調，產量和品質持續下降等一系列連作障礙問題[1-4]，嚴重阻礙了馬鈴薯產業可持續發展。引起作物連作障礙的原因是復雜的，是作物和土壤兩個系統內部諸多因素綜合作用結果的體現[5-6]。越來越多的研究表明，作物連作土壤根際微生態環境的生物學特性的變化，特別是化感效應可能是造成作物連作障礙的主要因子之一，而且對根際土壤的影響最為直接[7-8]。

化感物質的來源主要有植株地上部和凋落物的揮發、淋溶，根系的分泌和植株殘體的分解等途徑[9-11]。根系分泌物是植物發生化感作用的主要物質來源之一，從根系分泌物中發現的大部分化感物質對根際微生物的活力有很大影響[12]；同時，它們進入土壤后會對受體植物產生化感作用[13-14]。張愛華[13]等研究表明人參根系分泌物中的皂苷類成分對人參種子萌發、幼根生長和鮮質量均有抑制作用。張文明[15]等研究發現，馬鈴薯根系分泌物中含有的棕櫚酸和鄰苯二甲酸二丁酯顯著抑制了馬鈴薯生長。曲曉華[16]研究發現，大豆根系分泌物中的2，4-二叔丁基苯酚和香草酸對土壤微生物有化感作用。拱健婷[17]等研究發現，三七根系分泌物對小麥地上部化感作用以促進為主，對根部生長則以抑制作用為主。Bains等[18]報道了蘆薈分泌酚醛沒食子酸并與根際微生物聯合作用限制臨近植物生長。黃瓜根系分泌物中含有苯甲酸、對羥基苯甲酸、2，5-羥基苯甲酸、苯丙烯酸等11種酚酸物質，其中10種對自身具有生物毒性[19]。郭修武[20]等研究發現，葡萄根系分泌物中含有的羥基苯甲酸和水楊酸對葡萄具有顯著的化感抑制作用。

因此，植物根系分泌物通過化感作用抑制或促進作物生長，連作條件下根系分泌物的累積和化感作用的增強，可能會導致作物生長受阻，產生明顯的連作障礙。馬鈴薯是忌連作作物，目前對馬鈴薯的化感物質及化感作用機理需系統研究分析，以在明確馬鈴薯連作條件下根系分泌物化感作用機理的基礎上，尋求克服連作障礙的技術途徑。為此，本文依托大田定位試驗，采用GC-MS技術研究馬鈴薯不同種植模式根系分泌物的主要種類及主要物質的變化規律，揭示馬鈴薯連作障礙發生的可能機理，為探索馬鈴薯抗連作的技術途徑和物化產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在沿黃灌區甘肅省會寧縣郭城鎮紅堡子村布設的長期定位試驗田進行。試驗區海拔1 536 m，年平均氣溫6.7℃，年均降雨量320 mm，年蒸發量1 600 mm，≥10℃有效積溫2 400℃，年日照時數為2 500～2 800 h，光能資源豐富。土壤為灰鈣土，土壤有機質9.8 g·kg-1，速效氮17.3 mg·kg-1，速效磷20.6 mg·kg-1，速效鉀95.2 mg·kg-1。2015年馬鈴薯生育期降水量為89.3 mm，平均溫度20.4℃。

1.2 供試材料

供試馬鈴薯品種為克新2號，大豆品種為冀豆17，由甘肅省農業科學院提供。

1.3 試驗設計

試驗設3種種植模式：大豆-馬鈴薯輪作6 a、大豆/馬鈴薯間作6 a、馬鈴薯連作6 a；每個處理3次重復，9個小區，小區面積40 m2。帶幅150 cm，100 cm起壟覆膜種植2行馬鈴薯，壟高30 cm，密度47 625 穴·hm-2，行距45 cm，穴距33 cm。大豆50 cm種植2行，密度為15萬株·hm-2，行距40 cm。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 馬鈴薯根系分泌物的收集 每個處理每小區選3個點, 在馬鈴薯現蕾期分別挖取植株2株,清理干凈根系表面土壤, 將每小區3個樣點的植株混合, 帶回實驗室，放入根系分泌物連續收集裝置中，每處理重復3次。用蒸餾水反復連續淋洗根系，根系分泌物經XAD-4樹脂吸附后，用甲醇洗滌液100 mL洗出根系分泌物(洗4次，每次25 mL)，將甲醇提取液過0.45μm醋酸纖維微孔濾膜，在35℃下旋轉蒸發儀濃縮至10 mL后，放入4℃冰箱中備用。

1.4.2 根系分泌物衍生化條件 將制備好的根系分泌物1 mL用氮吹儀吹干，干樣經等量氯仿萃取后，靜置分層，吸取氯仿層，干燥后加入30 μL N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsily) trifluoroacetamide，BSTFA)，于70℃烘箱中，反應1 h，取1 μL用于GC-MS進樣分析。

1.4.3 GC/MS色譜及質譜條件 氣相色譜-質譜聯用儀(型號：GCMS 6890N/5973N；產地：上海；公司：俊齊儀器設備有限公司)，配有Agilent G4513A自動進樣器，Agilent DB-5MS 毛細管柱(0.25 mm×30 m×0.25 μm)，進樣口溫度為270℃。程序升溫：起始溫度60℃，以10℃·min-1速率升至280℃保持5 min。不分流進樣，溶劑延遲5 min，載氣為氦氣，純度≥99.999%，流速1.0 mL·min-1，進樣量為1 μL。離子源溫度為230℃，四級桿溫度150℃，掃描模式為全掃描。通過Agilent色譜工作站檢索NIST2008 質譜數據庫，結合人工圖譜解析，進行物質的鑒定，按面積百分比法計算測試樣品中各組成成分的相對含量。

1.5 數據分析

釆用SPSS 19.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和差異顯著性檢驗(LSD)。

2 結果與分析

2.1 不同種植模式下馬鈴薯根系分泌物的鑒定

3種不同種植模式馬鈴薯根系分泌物總離子質譜見圖1～3，對圖1～3中的總離子譜圖通過計算機檢索系統鑒定，按照相似度大于90%, 峰面積大于500 000, 得到不同種植模式馬鈴薯根系分泌的主要物質見表1。

馬鈴薯輪作處理根系分泌物GC-MS分析鑒定的主要物質，經MS計算機檢索，按照相似度大于90%，鑒定出29種化合物(圖1和表1)，其中烷烴類19種、酯類4種、酸類4種、胺類2種，所占比例分別為16.16%、6.9%、4.8%、1.1%。主要物質是鄰苯二甲酸二異丁酯、棕櫚酸、硬脂酸，相對含量分別為3.47%、2.20%、2.01%；其次是3-甲基-十八烷、十甲基-四硅氧烷、二十一烷、廿六烷、二十烷、二十七烷、十七烷、氨基甲酸酯，相對含量分別為1.84%、1.76%、1.74%、1.68%、1.6%、1.44%、1.41%、1.16%。其他成分相對含量均在1%以下，主要是烷烴類。馬鈴薯輪作處理根系分泌物中鄰苯二甲酸二異丁酯、棕櫚酸、硬脂酸、N,N-二乙基乙酰胺等均被報道有化感作用。

圖1 大豆-馬鈴薯輪作馬鈴薯根系分泌物總離子質譜圖Fig.1 GC-MS of total ion in potato root exudates under soybean and potato rotation cropping

薯豆固定間作處理馬鈴薯根系分泌物中鑒定出30種化合物(圖2和表1)，其中烷烴類22種、酸類5種、酯類1種、胺類1種、生物堿1種，所占比例分別為25.56%、7.94%、5.35%、1.63%、0.3%。主要物質是鄰苯二甲酸-丁基-異丁酯、十甲基-四硅氧、棕櫚酸、二十一烷、硬脂酸、二十五烷、3-甲基-十八烷，相對含量分別為5.35%、3.34%、3.08%、2.85%、2.81%、2.41%、2.04%，其次是三十一碳烷、十五烷、N,N-二乙基乙酰胺、丙酸、二十四烷、正十四碳烷、N,N-二乙基氨基甲酸酯、二十烷、二十七烷，相對含量分別為1.86%、1.81%、1.63%、1.39%、1.36%、1.2%、1.19%、1.03%、1%。其他成分相對含量均在1%以下。間作處理根系分泌物中鄰苯二甲酸-丁基-異丁酯、棕櫚酸、硬脂酸、N,N-二乙基乙酰胺、丙酸等均被報道有化感作用。

馬鈴薯連作6年的根系分泌物中鑒定出30種化合物(圖3和表1)，其中烷烴類21種、酯類2種、酸類4種、胺類2種、生物堿1種，所占比例分別為24.66%、7.87%、5.51%、2.54%、0.21%，主要物質是鄰苯二甲酸二丁酯、十甲基-四硅氧、N,N-二乙基氨基甲酸酯、棕櫚酸、硬脂酸、二十五烷，相對含量分別為5%、3.74%、2.87%、2.71%、2.56%、2.42%；其次是3-甲基-十八烷、十四烷、四十四烷、乙胺、二十八烷、十八烷、十六烷、二十二烷、十五烷、二十七烷、N,N-二乙基乙酰胺，相對含量分別為1.95%、1.7%、1.69%、1.46%、1.41%、1.41%、1.34%、1.23%、1.17%、1.13%、1.08%。其他成分相對含量均在1%以下。馬鈴薯連作6年處理根系分泌物中鄰苯二甲酸二丁酯、棕櫚酸、硬脂酸、鄰苯二甲酸-丁基-異丁酯、丙酸、N,N-二乙基乙酰胺等均被報道有化感作用。

圖2 大豆/馬鈴薯套作馬鈴薯根系分泌物總離子質譜圖Fig.2 GC-MS of total ion in potato root exudates under soybean and potato interplanting

圖3 連作6年馬鈴薯根系分泌物總離子質譜圖Fig.3 GC-MS of total ion in potato root exudates under continuous cropping for 6 years

2.2 不同種植模式對馬鈴薯根系分泌物的影響

由圖3和表1 可以看出馬鈴薯輪作、固定間作和連作處理分別鑒定出29種、33種和34種化感物質，其中有17種化合物在3種處理馬鈴薯根系分泌物中都被鑒定出來，但它們的相對含量有所不同，主要包括烷烴類、醇類、酯類、胺類、酸類和生物堿化合物，且烴類、酯類、酸類相對含量較高，平均為22.13%，6.7%，6.08%。說明馬鈴薯根系分泌物主要以結構較簡單的直鏈或支鏈烷烴為主，結構相對復雜的醇、酯、酸類有機化合物較少。

固定間作和連作6年處理馬鈴薯根系分泌物種類比輪作處理分別增加了13.79%和17.24%，烷烴類物質的相對含量分別為25.56%和24.66%，比輪作分別高出58.17%和52.60%，其中，連作6年處理馬鈴薯根系分泌物中十六烷相對含量為1.34%，輪作處理中相對含量僅為0.36%；連作6年處理馬鈴薯根系分泌物中十四烷的相對含量為1.7%，固定套作處理中的相對含量為0.09%，在輪作處理中未檢測到；四十四烷僅在連作6年處理馬鈴薯根系分泌物中檢測到，相對含量為1.69%；十八烷在連作6年處理中為1.41%，在固定間作處理中為0.67%，而在輪作處理中未檢測到。固定間作和連作6年處理馬鈴薯根系分泌物中酸類物質的相對含量分別為7.94%和5.51%，比輪作處理分別增加了65.41%和14.79%，其中，棕櫚酸相對含量比輪作處理分別增加了40.00%和23.18%，硬脂酸相對含量比輪作處理增加了39.80%和27.36%。

連作6年處理馬鈴薯根系分泌物中鑒定出乙胺、N-乙基嗎啉和鄰苯二甲酸二丁酯的相對含量分別為1.46%，2.87%和5%，但在輪作和間作處理根系分泌物中均未鑒定出。N,N-二乙基乙酰胺、棕櫚酸、硬脂酸在輪作、間作和連作處理根系分泌物中均被鑒定出，固定間作和連作6年馬鈴薯根系分泌物中的N,N-二乙基乙酰胺相對含量比輪作分別高出123.29%和47.95%，棕櫚酸含量比輪作分別高出23.18%和40.0%，硬脂酸含量比輪作分別高出27.36%和39.80%。

2.3 馬鈴薯幾種根系分泌物及其標準物離子質譜比較

通過對幾種疑似化感物質的標準物質離子質譜圖進行比較分析，計算機檢索系統鑒定出的馬鈴薯連作6年處理根系分泌物中乙胺匹配度達95%(圖4)，出峰時間為5.386 min，與乙胺標準物質離子質譜圖以及出峰時間一致。N,N-二乙基乙酰胺在輪作、間作和連作6年處理馬鈴薯根系分泌物中匹配度達90%、91%和90%，出峰時間為5.874，與N,N-二乙基乙酰胺標準物質離子質譜圖(圖5)以及出峰時間一致。棕櫚酸在3種種植方式馬鈴薯根系分泌物中鑒定的匹配度均達99%，出峰時間為17.646 min，與棕櫚酸標準物質離子質譜圖相似度達99%(圖6)，出峰時間一致。硬脂酸在3種種植方式馬鈴薯根系分泌物中鑒定的匹配度均達99%，出峰時間為19.445 min，與硬脂酸標準物質離子質譜圖相似度達99%(圖7)，出峰時間一致。N-乙基嗎啉在連作6年處理中匹配度達90%，出峰時間為6.316，與N-乙基嗎啉標準物質離子質譜圖(圖8)以及出峰時間一致。鄰苯二甲酸二丁酯在連作6年處理馬鈴薯根系分泌物中匹配度達97%，出峰時間為16.892 min，與鄰苯二甲酸二丁酯標準物質離子質譜圖(圖9)以及出峰時間一致?？梢?，棕櫚酸、硬脂酸、鄰苯二甲酸二丁酯3種化合物與其標準物質離子質譜圖相似度較高，均達97% 以上。

表1 不同種植模式馬鈴薯主要根系分泌物鑒定結果Table 1 Identification of main root exudates of potato under different planting pattern

圖4 乙胺標準物質(a)和樣品離子質譜圖(b)Fig.4 GC-MS of ion of ethylamine standard substance (a) and sample(b)

圖5 N,N-二乙基乙酰胺標準物質(a)和樣品(b)離子質譜圖分析 Fig.5 GC-MS of ion of N,N-diethyl-acetamide standard substance(a) and sample(b)

圖6 棕櫚酸標準物質(a)和樣品(b)離子質譜圖分析Fig.6 GC-MS of ion of hexadecanoic acid standard substance (a) and sample (b)

圖7 硬脂酸標準物質(a)和樣品(b)離子質譜圖分析Fig.7 GC-MS of ion of octadecanoic acid standard substance (a) and sample (b)

圖8 N-乙基嗎啉標準物質(a)和樣品(b)離子質譜圖分析Fig.8 GC-MS ion mass chromatogram of N,N-Diethyl carbamate of standard substance (a) and sample (b)

圖9 鄰苯二甲酸二丁酯標準物質(a)和樣品(b)離子質譜圖分析Fig.9 GC-MS of ion of dibutyl phthalate standard substance (a) and sample (b)

3 討 論

馬鈴薯根系分泌物中存在化感物質已有報道，并且棕櫚酸和鄰苯二甲酸二丁酯這2種化感物質已被證實具有化感自毒效應[14]，然而，根系分泌物中含有大量化感物質，這并不能證明已檢測出來的化感物質就是真正起決定性作用的化感物質。根系分泌物的組成復雜，不同植物的根系分泌物種類不同，但通常都有烴類、酸類、酯類等化合物[20]。本研究結果表明，馬鈴薯根系分泌物主要包括烷烴類、酯類、胺類、酸類和生物堿化合物，且烴類、酯類、酸類相對含量較高，這與上述的研究結論一致，但馬鈴薯根系分泌物主要以結構較簡單的直鏈或支鏈烷烴為主的研究還未見報道。Larkin[22]和張文明[23]認為，馬鈴薯連作后，土壤中有機酸類物質、特別是直鏈飽和脂肪酸的積累是導致馬鈴薯產量下降的原因之一。本研究中，固定間作和連作6年馬鈴薯根系分泌物中總酸類物質的相對含量高于輪作處理，并且直鏈飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸的相對含量顯著高于輪作處理，與上述研究結論一致。

根據各物質的相對含量及相關文獻報道，本研究鑒定出的4種根系分泌物棕櫚酸、硬脂酸、鄰苯二甲酸二丁酯、N,N-二乙基乙酰胺在花生[24]、人參[12,25]、辣椒[26]、茄子等作物上已被廣泛報道，并被證明具有化感作用，且棕櫚酸和鄰苯二甲酸二丁酯在馬鈴薯自毒物質研究中已有報道[23]，而本研究鑒定出的化感物質N,N-二乙基乙酰胺、硬脂酸在馬鈴薯化感物質中還未見報道，是否會對馬鈴薯生長有抑制作用還有待進一步研究，同時，鑒定出的乙胺和N-乙基嗎啉是否為化感物質還有待進一步驗證。根系分泌物的種類很多，可能還有一些分泌量較少，毒性較強的物質沒有被檢測出來，進一步系統研究這些物質成分，以及他們對植物以及相互間的作用，對闡明馬鈴薯根系分泌物化感作用的本質有重要作用。

4 結 論

不同種植模式下馬鈴薯根系分泌物中有17種化合物均被鑒定出，主要以結構較簡單的直鏈或支鏈烷烴為主，還包括酯類、胺類、酸類和生物堿等化合物。大豆-馬鈴薯輪作模式較大豆/馬鈴薯間作和馬鈴薯連作模式可有效降低根系分泌物中烷烴類、酸類、胺類等種類的含量。連作處理根系分泌物中鑒定出乙胺、N-乙基嗎啉和鄰苯二甲酸二丁酯，而在輪作和間作處理中均未檢測到。間作和連作處理鑒定出N,N-二乙基乙酰胺、棕櫚酸、硬脂酸相對含量均高于輪作處理。因此，生產實踐中，可通過大豆-馬鈴薯輪作克服因某一種馬鈴薯化感物質累積而造成的毒害作用。