極端嗜熱菌Thermosipho melanesiensis 普魯蘭酶基因的異源表達與酶學性質分析

王明道，邢 巖，邱 爽，王紅陽，孫利鵬，邱立友*

(1． 河南農業大學 農業部農業微生物酶工程重點實驗室，河南 鄭州 450002;2． 河南仰韶生化工程有限公司，河南 澠池472400)

0 引言

普魯蘭酶(pullulanase)是一種重要淀粉脫支酶[1]，可以水解支鏈淀粉中的α-1,6-糖苷鍵，提高支鏈淀粉的水解效率.根據作用位點的不同將普魯蘭酶分為兩類[2]：專一性水解普魯蘭糖和支鏈淀粉中的α-1,6-糖苷鍵生成麥芽三糖和直鏈淀粉的Ⅰ型普魯蘭酶(type I pullulanase， EC.3.2.1.41)，屬于糖苷水解酶GH13家族(glycoside hydrolase 13，GH13)；不僅能水解普魯蘭糖和支鏈淀粉中的α-1,6-糖苷鍵而且能水解淀粉中α-1,4-糖苷鍵的Ⅱ型普魯蘭酶(type Ⅱ pullulanase, EC.3.2.1.1/41)，屬于糖苷水解酶GH13和GH57家族[3].

普魯蘭酶在工業上被較多的用于淀粉的加工中的糖化反應[4].糖化反應是在溫度60 ℃、pH 5.0 的條件下利用糖化酶將糊精和低聚糖進一步水解為葡萄糖和麥芽糖的過程.其中糖化酶對 α-1,6-糖苷鍵的水解效率特別低[5].而在糖化反應時加入普魯蘭酶(也稱極限糊精酶)可以最大限度地減少糊精生成量，使麥芽糖的含量提高到 924 g/kg[6].

在糖化反應中的作用條件要求普魯蘭酶具有較高的熱穩定性.嗜熱酶是指最適反應溫度在60 ℃ 以上的一類水解酶.目前，已有許多嗜熱性普魯蘭酶被開發出來.1966年，德國學者WALLENFELS 和 BENDER[7]對來自于產氣桿菌 (Aerobacteraerogenes) 中的普魯蘭酶進行了純化和酶學性質研究，結果表明在100 ℃ 條件下溫育3 min，其酶活可保持原始酶活的 80%.1984年，丹麥Novo公司[8]獲得一株能夠分解普魯蘭糖的嗜酸性芽孢桿菌 (Bacillusacido-pullulyticus)，此菌產生的普魯蘭酶最適溫度為60 ℃ .2000年，KRIEGSHUSER和 LIEBL等[9]測定了來源于Thermotogamaritima的普魯蘭酶的性質，該酶在90 ℃ 條件下的半衰期為3.5 h.2002年MESSAOUD等[10]報道了來源于Bacillusthermoleovorans的普魯蘭酶，其最適溫度為75 ℃. 2009年，徐金利等[11]分離到一株編碼熱穩定性普魯蘭酶的嗜熱球菌Thermococcussp. HJ21，該普魯蘭酶在 80～100 ℃ 條件下仍保持較高的酶活性，在100 ℃保溫2 h仍有 50% 以上的酶活.2014年，吳華偉等[12]分析了來自于ThermusthermophilusHB27的熱穩定性普魯蘭酶的性質，結果顯示該普魯蘭酶在 60～70 ℃ 下溫育2 h 后其活性仍保持 90%，并且在 80 ℃ 下半衰期為2 h.2016年,KAHAR等[13]分析了來自于Anoxybacillussp. SK3-4的普魯蘭酶，該酶在最適溫度為60 ℃.2017年，高濤等[14]分離出來自于解淀粉芽孢桿菌的普魯蘭酶，該酶的最適溫度是60 ℃,在70 ℃保溫4 h后酶活力殘留在60%以上.

極端嗜熱菌Thermosiphomelanesiensis是ANTOINE等[15]從西南太平洋深?；鹕娇诜蛛x出來的一株嚴格厭氧的超嗜熱菌，其最佳生長溫度為70 ℃，基因組全長為1 915 kb，含有多個注釋的酶基因，如鐵氧還原蛋白(登錄號：WP_012056246.1)、糖苷水解酶(登錄：WP_012056988.1)和本文中要研究的普魯蘭酶(登錄號：WP_012056687.1)，但目前為止已經被驗證功能的蛋白寥寥無幾.

因此本研究從德國菌種保藏中心購買的基因組Thermosiphomelanesiensis(DSM 12029)，將該普魯蘭酶基因進行異源表達后進行了酶學性質分析.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌Rosetta(DE3)和DH5α為實驗室保藏菌株.Thermosiphomelanesiensis的基因組購自德國菌種保藏中心.

1.2 試劑與藥品

普魯蘭糖，東京化成工業株式會社；Co2+螯合瓊脂糖凝膠TALON Metal Affinity Resin，TaKaRa公司產品；限制性內切酶NheⅠ和XhoⅠ、T4 DNA Ligase、Q5 超保真DNA聚合酶，NEB公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA產物純化試劑盒、質粒小量提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司.

1.3 重組質粒的構建

根據NCBI上公布的嗜熱菌株Thermosiphomelanesiensis的普魯蘭酶基因序列設計并合成引物，序列如下：

FTM:5′CTAGCTAGCATGAAAAGATTGTTAGTGTTTTTCTTTGTTTTGTTATC3′

RTM:5′TCCGCTCGAGTTTGTTCTTGTAAAAAACATATGCAGAAATTCCTTC3′

PCR擴增嗜熱菌Thermosiphomelanesiensis中的普魯蘭酶基因TP-pulA，反應體系(50 μL)：ddH2O，34 μL；5×Q5 反應緩沖液，10.0 μL；10 mmol/L dNTPs，1.0 μL；上游特異引物F(10 μmol/L)，2 μL；下游特異引物R(10 μmol/L)，2 μL；DNA 模板(TP基因組) 0.5 μL，Q5酶(2 U/ μL)，0.5 μL.反應條件：98 ℃預變性3 min，98 ℃變性40 s，66 ℃退火15 s，72 ℃延伸80 s，共35個循環，72 ℃延伸4 min.切膠純化后4 ℃保存備用.

TM-pulA雙酶切反應體系(50 μL)：ddH2O，10.0 μL；10×Cursmart緩沖液，5.0 μL；NheI, 1.0 μL; XhoI , 1.0 μL; 純化后的TM-pulA(29 mg/L)，33.0 μL.反應條件：37 ℃保溫3 h，65 ℃滅活30 min.切膠純化后4 ℃保存待用.

設置pET21a雙酶切反應體系(50 μL)：ddH2O，28.0 μL；10×Cursmart緩沖液，5.0 μL；NheI, 1.0 μL; XhoI , 1.0 μL; 純化后的pET21a(79 mg/L)，15.0 μL.反應條件：37 ℃保溫3 h，65 ℃滅活30 min.切膠純化后4 ℃ 保存待用.

用T4 DNA ligase連接純化后的酶切產物，連接體系如下：ddH2O，8.0 μL；純化后的pET21a-TP-pulA(59.8 ng/μL)，2.0 μL；線性的pET21a(12.1 mg/L)，7 μL；T4 DNA 連接酶，1.0 μL；10×T4 DNA連接酶緩沖液，2 μL.反應條件如下：16 ℃，16 h，65 ℃滅活30 min.轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂板，挑取陽性克隆，提取質粒.將位置正確的質粒送金唯智公司測序.

1.4 目的基因的誘導表達與純化

將測序正確的質粒轉入大腸桿菌Rosetta(DE3)中，挑取轉化子到含抗生素(氯霉素終濃度0.036 g/L ，氨芐西林0.1 g/L)的5 mL LB培養液中，37 ℃培養12～16 h，取 2 mL 菌液接種到200 mL 含抗生素(同上)液體 LB 培養基中，37 ℃、220 r/min 培養 2～3 h(OD600值0.6～0.8)，加入終濃度0.2 mmol/L的IPTG，220 r/min、30 ℃ 培養 6～8 h.于4 ℃、6000 r/min下，離心10 min收集菌體，加入0.1倍發酵液體積的蒸餾水使菌體充分混勻，放置冰上進行超聲波破碎(3 s× 4 s× 99次)，4 ℃、12 000 r/min，離心30 min，取出上清作為粗酶液.經Co2+螯合瓊脂糖凝膠進行純化后4 ℃保存待用.

1.5 酶水解產物分析

分別配制濃度為1%的葡萄糖、麥芽二糖、麥芽三糖和普魯蘭糖標準溶液；將100 μL粗酶液與100 μL 1%的普魯蘭糖混合均勻，在70 ℃條件下保溫30 min.

分取10 μL上述樣品進行薄層色譜分析.上行展開兩次.將展開后的硅膠板用10%的硫酸乙醇顯色，顯色條件為高溫烘箱100 ℃加熱10 min.

1.6 酶學性質分析

1.6.1 最適pH值

配制pH值為5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0的磷酸緩沖液.在冰浴條件下，每100 μL酶液，加入100 μL 1%普魯蘭糖和100 μL不同 pH 的磷酸緩沖液，在70 ℃條件下反應15 min，加入600 μL DNS溶液終止反應，煮沸10 min顯色，冷卻后用蒸餾水定容至5 mL，混合均勻，在540 nm波長下測吸光值.以滅活的酶液作為對照，每個反應設置 3 個重復，取平均值.繪制曲線，從而確定酶最適反應 pH值.

1.6.2 最適溫度

設置溫度梯度為55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃.在冰浴條件下，每100 μL酶液，加入100 μL 1%普魯蘭糖和100 μL最適pH值下的磷酸緩沖液，在不同的溫度條件下反應15 min，加入600 μL DNS溶液終止反應，煮沸10 min顯色，冷卻后用蒸餾水定容至5 mL，混合均勻，在540 nm波長下測吸光值.以滅活的酶液作為對照，每個反應設置 3 個重復，取平均值.繪制曲線，從而確定酶的最適反應溫度.

1.6.3 半衰期

將酶液在70 ℃下保溫，分別在0、3、6、9、12 h取出450 μL樣品置于冰水混合物中，待全部取出后進行反應.在冰浴條件下，取100 μL不同保溫時間的酶液，加入100 μL 1%普魯蘭糖和100 μL最適 pH 下的磷酸緩沖液，在最適溫度下反應15 min，加入600 μL DNS溶液終止反應，煮沸10 min顯色，冷卻后用蒸餾水定容至5 mL，混合均勻，在540 nm波長下測吸光值.每個反應設置 3 個重復，取平均值.繪制半衰期曲線，從而確定酶的半失活時間.

1.6.4 不同化學試劑對酶活的影響

用與最適pH的磷酸緩沖液酸堿度一樣的蒸餾水分別配制濃度為10 mmol/L NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、ZnCl2、MnCl2、CoCl2、AlCl3、FeCl3、SDS、EDTA 的溶液.在冰浴條件下，分別取100 μL上述溶液加入到100 μL酶液中，使其終濃度為5 mmol/L，在50 ℃水浴鍋中保溫30 min.然后向上述保溫的體系中分別加入100 μL 1%普魯蘭糖，在最適溫度下反應15 min，加入600 μL DNS溶液終止反應，煮沸10 min顯色，冷卻后用蒸餾水定容至5 mL，混合均勻，在540 nm波長下測吸光值.以滅活的酶液做對照，以未加入化學試劑測得的酶活為100%，每個反應設置3個重復，取平均值.繪制柱狀圖，分析不同化學試劑對TM-pulA酶活的影響.

1.6.5 酶促動力學參數

分別配制濃度為2、4、6、8、10、12、14、16 g/L的普魯蘭糖溶液作為底物.在冰浴條件下，取100 μL 稀釋后的純酶液，100 μL最適pH的磷酸緩沖液和 100 μL不同濃度的普魯蘭糖底物混合，最適溫度下反應10 min；加入600 μL DNS 溶液，煮沸10 min，冷卻后用蒸餾水定容至5 mL，混合均勻，在540 nm波長下測吸光值.以滅活的酶液做對照，每個反應設置 3 個重復，取平均值.將測得的 OD 值代入葡糖糖標準曲線，計算酶水解不同濃度底物得到的還原糖質量，從而算出不同底物濃度[S]下酶的反應速度V，根據 Hanes-Woolf 法作圖以 [S]/V-[S] 作散點圖，并進行線性擬合得一直線，斜率為 1/Vmax，與坐標軸橫軸的截距為-Km.計算得到Km、Vmax、Kcat及Kcat/Km的值.

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建

以 FTM、RTM為引物，以Thermosiphomelanesiensis的基因組為模板擴增得到的普魯蘭酶基因TM-pulA，大小為2529 bp；重組質粒如圖1所示.將該質粒送金唯智測序，測序結果與理論序列完全一致.

圖1 重組質粒pET21a-TM-pulA的電泳圖Fig. 1 Electrophoresis of plasmids of pET21a-TM-pulA

2.2 酶的純化及結果分析

TM-pulA經Co2+螯合瓊脂糖凝膠純化后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，如圖2所示，TM-pulA純化后仍有一條雜帶，但雜帶的蛋白量特別低，后續實驗將忽略該雜帶產生的影響.

2.3 酶水解產物分析

用TLC板檢測TM-pulA的水解普魯蘭糖的產物，如圖3所示，TM-pulA可以水解普魯蘭糖，而且水解產物是麥芽三糖，可以推斷TM-pulA作用于普魯蘭糖時主要水解α-1,6-糖苷鍵，說明TM-pulA是Ⅰ型普魯蘭酶.

圖2 TM-pulA純酶的 SDS-PAGE檢測Fig. 2 SDS-PAGE analysis of pure enzyme

圖3 TM-pulA的水解產物的 TLC 檢測Fig. 3 Analysis hydrolyzate of TM-pulA

2.4 純酶的酶學性質分析

2.4.1 最適pH

TM-pulA 的最適 pH 是 5.8,見圖4.作用范圍比較寬，在 pH 5.0～6.4 范圍內保持最適酶活的 80% 以上.

2.4.2 最適溫度

用純化后的 TM-pulA 進行最適溫度的測定.如圖5所示，TM-pulA最適溫度是 80 ℃.因此，TM-pulA是嗜熱酶.

2.4.3 半衰期

TM-pulA半衰期的結果如圖6所示.根據酶殘余酶活與保溫時間的指數函數計算出 TM-pulA在 70 ℃下的半失活時間為 4.75 h，說明TM-pulA具有較高的熱穩定性.

圖4 TM-pulA 純酶的最適pHFig. 4 The optimum pH of pure enzyme

圖5 TM-pulA 純酶的最適溫度Fig. 5 The optimum temperture of pure enzyme

圖6 TM-pulA純酶的半衰期Fig. 6 The half-life of pure enzyme

2.4.4 不同化學試劑對酶活的影響

不同化學試劑對酶活的分析結果如7所示.終濃度為5 mmol·L-1的Na+、K+、Ca2+、Mg2+對TM-pulA的酶活沒有明顯的促進作用； 終濃度為5 mmol·L-1的Mn2+、Co2+、AL3+、Fe3+、SDS及EDTA對TM-pulA的酶活有不同程度的抑制作用，其中在終濃度為5 mmol·L-1的SDS的作用下TM-pulA的活性基本喪失.

圖7 部分化學試劑對 TM-pulA酶活的影響Fig. 7 Effects of Different chemical reagenton enzyme activity of TM-pulA

1. CK; 2. NaCl; 3. KCl; 4. CaCl2; 5. MgCl2; 6. ZnCl2; 7. MnCl2; 8.CoCl2; 9. AlCl3; 10. FeCl3; 11. SDS; 12.EDTA

2.4.5 酶促動力學參數

對酶的動力學參數進行分析，根據Hanes-Woolf作圖法得到如圖8所示的曲線.通過計算得到Km、Vmax、Kcat及Kcat/Km分別為4.68 g·L-1, 0.0085 mmol·L-1·s-1, 71.18 s-1和15.21 L·g-1·s-1.

圖8 TM-pulA的酶促動力學參數Fig. 8 Kinetic parameters of TM-pulA of pullulan

3 結論

將來源于Thermosiphomelanesiensis的普魯蘭酶與數據庫中已經驗證功能的普魯蘭酶進行同源性比對，結果發現來源于嗜熱微生物Thermosiphomelanesiensis的TM-pulA與FervidobacteriumpennivoransVen5[16,17]來源的普魯蘭酶基因(登錄號：WP_041263510.1)的相似度最高，堿基序列同源性為74%；來源于FervidobacteriumpennivoransVen5的普魯蘭酶的最適溫度和最適pH分別為85 ℃和6.0，在80 ℃下的半衰期為2 h.二者相似度最高卻在酶學性質上有很大的差異，說明TM-pulA是新的普魯蘭酶.

該普魯蘭酶最適溫度為85 ℃，pH值是5.8，并在pH值5.0～6.4范圍內仍能保持最適活性的80%左右.基本滿足了糖化反應所要求的溫度60 ℃、pH值5.0的要求.然而，該酶在還存在表達量不夠高的問題.后期本課題組將通過定點突變、酶分子改造等手段繼續研究，以真正實現該酶的工業化.