草魚家系選育中的親子鑒定研究

武 棟

（山西省魚病防治中心 山西太原 030002）

微衛星標記，又被稱為短串聯重復序列或簡單重復序列，是均勻分布于真核生物基因組中的簡單重復序列，由2～6個核苷酸的串聯重復片段構成，由于重復單位的重復次數在個體間呈高度變異性并且數量豐富，因此微衛星標記的應用非常廣泛。微衛星位點通常通過PCR擴增，擴增產物通過電泳分析并根據大小分離等位基因進行檢測。根據微衛星的重復類型可以把微衛星分為完全、不完全和復合型微衛星。微衛星在基因組中數目巨大，據估計，真核基因組中平均每6kb就存在一個微衛星序列[1]。毛細管電泳法是一項高效快速的分離分析技術，該方法以PCR擴增含有微衛星位點的目的DNA片段為基礎，然后利用毛細管電泳法分離分析。毛細管電泳法主要是快速、微量、分辨率高、重復性好、易于定量和適合自動化檢測等優點，它能保證系統的穩定性和PCR擴增的效果。因此，微衛星標記是強大的家庭跟蹤工具[2]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料來自長江水系四大家魚原種場人工繁殖的草魚群體，包含該群體的所有親本（父本14尾及母本16尾）及隨機抽取的子代66尾，共96尾。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本收集及基因組DNA的提取

草魚30尾親本和隨機子代樣本66尾，剪取尾鰭，用95%乙醇浸泡，置4℃保存。本實驗所用的軟體動物基因組DNA提取試劑盒和提取草魚鰭條DNA的方法均由天根生化科技有限公司提供。鰭條DNA提取后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA提取物的完整性和純度，并存儲在-20℃冰箱備用。

1.2.2 引物來源

本試驗10個微衛星引物參照現已發表的文獻[3]，由廣州省艾基生物工程技術公司合成。

1.2.3 PCR擴增及檢測

反應體系共 20 μL：1.2 μL 的基因組 DNA，0.2 μL的 10×buffer，0.8 μL 25 mmol/L 的 Mg2＋，0.2 μL 5U/μL的 Taq 酶，稀釋后的上、下游引物各 0.5 μL，0.3 μL 10 umol/L 的 dNTPs，14.5 μL 雙蒸水。反應程序為：94℃預熱 2 min；94℃變性 30 s，適當退火溫度下 30 s，72℃延伸 30 s，循環 30次；72℃延伸 5 min；12℃保存。

1.2.4 毛細管電泳的方法

PCR擴增結束后，擴增產物經2000 r/min離心1 min，室溫放置2～3 min，開蓋后觀察，確定沒有氣泡后，在每個產物的液面上層覆蓋10 μL礦物油以防止樣品蒸發，按順序置于Qsep100全自動核酸蛋白分析系統的樣品托盤上，并設置電泳檢測參數進行毛細管電泳。本實驗中，檢測時采用將兩種PCR產物（片段大小可區分）各取10 μL混合的方法，以節省電泳及分型時間。電泳檢測參數為：6 kV進樣2 s，6 kV電泳5 min。電泳結束后，用Q-ANALYZER軟件對電泳結果進行分析與矯正，根據擴增產物分子量的大小差異，對每個個體的微衛星基因座進行分型。

1.3 統計分析

用Cervus 3軟件allele frequency analysis程序來分析他們的非親排除率、觀測和期望雜合度、Hardy Weinberg均衡、無效等位基因頻率、多態信息含量、等位基因數等參數，并根據各位點的非親排除率計算累計非親排除率。用SimulLation of Parentage Analysis程序進行10000次模擬鑒定實驗，用Parentage Analysis程序對樣本進行親權鑒定。

2 結果

2.1 挑選的微衛星引物

對試驗中10對引物的PCR結果進行檢測。檢測結果顯示全部穩定清晰，且多態性表現良好。

2.2 遺傳參數分析

表1給出了10個微衛星多態位點在草魚隨機個體中的遺傳參數分析結果。

由表1可知，所檢測的10個微衛星標記中，有1個低度多態位點（PIC≤0.25），無中度多態位點（0.25＜PIC＜0.5），有 9個高度多態位點（PIC≥0.5）。10個微衛星標記分析檢測得到了162個等位基因，其中等位基因數最少的為Cid0029，檢測到4個；等位基因數最多的為Cid0004，檢測到30個。每個微衛星位點的平均觀測雜合度介于0.147～0.813之間，無效等位基因頻率均介于0.068 6～0.292 8之間；平均期望雜合度介于0.222～0.945之間。

2.3 遺傳多樣性統計結果

表2所示是親本草魚（F0）和子代草魚（F1）的遺傳多樣性變化。親本的平均多態信息含量（PIC）為0.8067，平均期望雜合度（He）為0.831 8，平均觀測雜合度（Ho）為0.6568，平均每個位點有16.2個等位基因；子代的平均多態信息含量（PIC）為0.821 7，平均期望雜合度（He）為 0.835 6，平均觀測雜合度（Ho）為0.590 7，平均每個位點有18.1個等位基因。

表1 10個微衛星多態位點在草魚隨機個體中的遺傳參數分析

表2 子代和親本的多樣性

2.4 非親排除率統計結果

圖1給出了10個微衛星位點的非親排除率。

由圖1可知，10個微衛星位點，當兩個親本的基因型是未知時，單個非親排除率ne-1p在0.214～0.985之間，平均值為0.382 7；當一個親本基因型是已知時，另一個非親排除率ne-2p在0.12～0.912之間，平均值為0.263 3；非親親本組合的排除率ne-pp在0.025～0.839之間，平均值為0.140 2。由以上數據可知，低排除率的微衛星位點被證明適用于親子鑒定。

2.5 模擬分析結果

模擬條件在親本已知和未知情況下，測定了親子鑒定的準確率、錯配率及置信度。當已知親本性別時，母本16個、父本14個、子代樣本10 000個，真實親本采樣率為100%，相關參數為：鑒定準確率為95%，錯配率為5%，置信度為95%，數據缺失率為0。當已知單獨母本時，相關參數為：鑒定準確率為100%，錯配率為0，置信度為96%。由模擬分析數據可知，在理想狀態下，親本的親子鑒定可用10個微衛星位點表示，達到了較高的96%的置信度和100%的鑒定準確率。

2.6 實際鑒定結果

實際分析全部位點相關參數為：單獨母本已知情況下，鑒定成功率為97%，錯配率為3%，置信度為95%。該結果與模擬分析數據非常接近，說明鑒定結果具有可信性。因此，本試驗以母本作為家系分類的依據可將該群體分為9個半同胞家系。

3 討論

3.1 PCR體系的選擇

目前大多都使用多重PCR的研究方法，是多重PCR引物使用熒光標記的設計和篩選指標，通過這種方法可以建立多重PCR，由于不同引物的使用，使熒光標記引物呈現不同顏色，因此只需要考慮它們之間的相容性。本試驗在進行毛細管電泳時，采用類似于多重PCR技術原理，將兩種PCR產物混合，以便縮短基因分型時間，提高工作效率。因此，在PCR設計基本原則的基礎上只需考慮選取的各位點擴增的產物片段有一定間隔。

3.2 家系鑒定影響因素

對家系鑒定的主要影響因素有：1）在進行毛細管電泳過程中，機器運行時由于機器的封閉性，可能會導致溫度上升對結果造成一定影響。針對這一問題采用風扇降溫的方法，從而降低溫度對實驗的影響；2）在基因分型時要對原始數據進行校準，不然可能會造成遺漏。對于差距較大的數據，在其他條件不變的情況下需重新進行毛細管電泳，并重新校準機器，減少因試驗誤差而帶來的影響。

圖1 10個微衛星位點的非親排除率

4 結論

近年來，微衛星標記技術在水產原良種選育、種質遺傳鑒定以及資源增殖與評價等多方面得到了研究和應用。家系選擇的本質是基因型的選擇，是通過逐代富集優勢基因型，以選育出純度較高的優良性狀的目的基因，正確把握近親交配繁殖和建立品系是家系選擇的關鍵。通過一對一交配建立起家系，生育累積隱性基因百分比的增加，純合基因表達，增加隱性性狀的概率，從而加快了一些不良基因的消除，使累積良好品質相關基因的概率大大提高，最終獲得經濟性狀最好的品種。在家系的選擇過程中，準確的系譜信息可以有效地指導親本的選擇和保留，從而縮短育種周期，提高育種效率。

在本次試驗研究中，通過使用微衛星標記來獲取草魚系譜信息時，置信水平能夠達到95%以上，說明本研究所選的微衛星標記可在漁業生產及科研試驗中用于獲取草魚系譜信息，并可根據子代的相關性狀參數，對優良品種的家系選育進行定向選擇和繁育，使原良種的生物性狀、生產性能更加適合漁業生產需要及市場需求，從而提高漁業生產的技術水平和水產品的市場競爭力，促進漁業經濟的健康可持續發展。