綿羊血小板糖蛋白4基因(CD36)的克隆及在不同生長時期卵泡中的表達

李曉林，吳陽升，林嘉鵬，汪立芹，黃俊成*，賈 斌

【研究意義】經卵泡刺激素(FSH)處理一月齡羔羊后，可導致比成年羊多10倍以上的卵泡發育[1]。故以羔羊為供體可以為胚胎體外生產提供大量的卵母細胞資源，從而縮短世代間隔。對卵泡發育相關基因的篩選與功能研究對于綿羊的育種具有重要科學意義和應用前景。我們在比較激素誘導羔羊和成年羊激素誘導后發育卵泡顆粒細胞轉錄組差異時，鑒定到超過300個基因的在轉錄水平有顯著差異。其中FSH誘導后羔羊血小板糖蛋白4基因(Cluster of differentiation 36 ，CD36)的表達顯著下調，而成年羊在激素誘導前后則無顯著變化[2]。故推測羔羊卵泡顆粒細胞中存在與成年羊不同的TSP-1信號通路，該通路可能與羔羊卵泡的超數發育數量有關，即與卵泡的募集有關?！厩叭搜芯窟M展】卵泡的發育和排卵需要大量旁分泌、自分泌和內分泌因子的協同作用，該過程中涉及到很多重要的生理過程，如血管生成[3]。卵巢血管生成的重要調節因子是血管內皮生長因子(VEGF)，研究表明CD36是影響小鼠血管和卵泡生成的重要因子[4]。CD36是一種跨膜糖蛋白受體，又被稱為脂肪酶轉位酶(Fatty acid translocase ，FAT)，B族清道夫受體3(Scavenger receptor class B member 3，SCARB3)等[5]。CD36由CD36基因編碼，位于人的7號染色體上，有15個外顯子[6]。CD36蛋白由1個包含472個氨基酸的單肽鏈組成。組織成2個跨膜結構域：2 個非常短的細胞質域和1個大的糖基化的胞外結構域[7]。研究表明，CD36在人類的心臟和腎臟的肌細胞有大量表達[8]，比較明確的作用有影響人血管發生[9]，動脈粥樣硬化[10]，炎癥和脂類代謝等[11]。目前該基因在綿羊各個組織中的表達和對綿羊卵泡發育是否有影響還未見研究?！颈狙芯壳腥朦c】本文以新疆阿勒泰羊為研究對象，利用PCR擴增CD36 CDS區全長，對克隆的CD36的理化性質，二級結構，功能域等進行生物信息學分析，同時構建分子系統進化樹。在mRNA水平上分析CD36在不同組織和不同發育時期卵泡中表達差異，【擬解決的關鍵問題】以期為后續深入研究CD36基因的功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

阿勒泰羊選自新疆畜牧科學院綿羊繁育基地，在1周歲時選取5頭健康綿羊進行屠宰，取卵巢和其他其他7個組織(心、肝、脾、肺、腎、肌肉、卵巢)，放于RNA保護劑中，4 ℃保存1夜后提取RNA。

1.2 引物設計

根據GenBank中綿羊CD36基因預測序列(XM_012176586.2)，采用Primer 5.0軟件設計了2對引物(1對引物用于擴增CD36基因的CDS序列，1對為實時熒光定量引物)。以GAPDH基因作為內參基因(登錄號：AF017079.1)，序列見表1。所有引物自行設計后由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

利用Trizol酚-氯仿法抽提綿羊不同組織和不同直徑(< 3 mm，小卵泡；3～5 mm，中卵泡；>5 mm，大卵泡)卵泡總RNA。2 %凝膠電泳后于凝膠自動成像儀(Gene)中成像。利用核酸測定儀檢測總RNA的純度和濃度，-80 ℃保存備用。

以各個組織和不同直徑卵泡RNA為模板，利用反轉錄試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)進行cDNA合成。反應體系20 μl：5×TransScriptAll-in-One SuperMix for qPCR 4 μl，gDNA Remover 1 μl，總RNA 1 ng，加ddH2O至20 μl。

1.4 克隆測序

以綿羊第1條cDNA鏈為模板進行PCR擴增，體系為25 μl：cDNA 2 μl，2× Master SupermixTaq酶(北京全式金有限公司)12.5 μl，上下游引物各1μl，ddH2O 8.5 μl。PCR反應條件: 95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35個循環，72 ℃延伸10 min，10 ℃ 保存。PCR 產物采用DNA柱式膠回收試劑盒(北京全式金)純化后與pMD19-T載體連接。挑取單克隆菌落，接種于含AMP的0.5 mL LB培養基，37 ℃，200 r/min振蕩3～4 h。根據菌液PCR結果，挑選陽性克隆送測序(上海生工)。

1.5 實時熒光定量PCR

以2 μl不同組織cDNA為模板，25 μl體系另外包括：Green qPCR SuperMix 12.5Ul，上下游引物各1 μl，RNase-free H2O 9 μl。PCR反應條件為: 95 ℃預變性30 s；然后95 ℃ 5 s，引物特異Tm15 min，55 ℃ 3 min，循環40次。熔解曲線分析: 95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，然后以0.5 ℃/10 s的速率從55 ℃緩慢遞增到95 ℃。反應在Rochol Light Cycler 480 II熒光定量PCR儀上進行，每次每一板上設置標準品、未知樣品(各重復3次)和1個陰性對照。

表1 TSP-1基因的PCR擴增及實時熒光定量PCR引物

表2 不同物種CD36 基因GenBank登錄號

表3 蛋白質結構功能預測(軟件或網址)

1.6 統計分析

基因的mRNA表達定量采用相對Ct(ΔCt)法：目標基因Ct-GAPDHCt. ΔCt值在進行樣品間比較(ΔΔCt)：樣品2ΔCt-樣品1ΔCt。實時熒光定量PCR的最終結果計算公式為2-ΔΔCt。

1.7 系統進化樹分析

根據克隆得到的CD36基因序列和從GenBank下載的基因序列核苷酸序列，使用Mega6.0中的鄰接法(NJ)構建進化樹。不同物種GenBank登錄號見表2。

1.8 生物信息學分析

利用DNAMAN軟件將CD36的核苷酸序列翻譯成氨基酸，通過DNAStar等生物信息學分析軟件和在線分析軟件預測蛋白的一級結構、理化性質、親/疏水性和信號肽、二級結構等，預測所要使用的方法見表3。

2 結果與分析

2.1 CD36基因PCR擴增及序列分析

由圖1顯示，將阿勒泰羊耳組織CD36基因CDS區序列進行PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測得到片段長度為1614 bp，條帶單一，片段長度與預期大小相符。

2.2 CD36基因CDS區序列及蛋白功能位點分析

由圖2表示，經測序和拼接后，得到1419 bp的CDS區全長，共編碼472個氨基酸。與預測序列(登錄號：XM_012176583.2)相比，CD36的編碼區序列完全一致，不存在變異位點。

M：BM2000 DNA marker；1：CD36 PCR擴增結果；2：陰性對照圖1 CD36基因PCR擴增產物Fig.1 PCR amplification product of CD36 gene

圖2 綿羊CD36基因核苷酸序列及翻譯氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and translated amino acid sequence of CD36 gene in sheep

2.3 蛋白結構與功能分析

利用在線軟件分析，CD36蛋白分子式為C2411H3769N615O680S18，原子總量為7491，分子量約為52.8 ku, 帶正電荷和負電荷的氨基酸殘基數分別為45和50個，其理論等電點pI為8.50；經計算CD36蛋白不穩定系數為32.61(<40)，脂肪指數為97.01,最大疏水性位于第9位氨基酸(Score: 2.433)，最大親水性位于457位氨基酸(Score: 3.178)；整體來看親水性區域大于疏水性區域，總平均親水性為0.021(>0)(圖3)；信號肽分析結果顯示CD36蛋白原裂解位點(C值)在和聯合裂解位點(Y值)在氨基酸21位評分最高(0.186和0.224)，信號肽存在于氨基酸的1～20位(圖4)；跨膜區分析CD36蛋白存在兩個跨膜螺旋結構，分別位于氨基酸的7～29位和441～463位(圖5)；二級結構分析TSP-1蛋白含22個a螺旋(alpha helix) ，31個β折疊延伸鏈(extended strand)， 24個轉角(turn)和15個無規則卷曲(random coil)(圖6)。

圖3 綿羊CD36蛋白的親/疏水性分析Fig.3 Hydrophilic/hydrophobic analysis of CD36 protein in sheep

圖4 綿羊CD36蛋白信號肽分析Fig.4 Signal peptide analysis of CD36 protein in sheep

圖5 綿羊CD36蛋白跨膜區域分析Fig.5 Transmembrane domain analysis of CD36 protein in sheep

利用在線軟件分析CD36蛋白的功能位點發現，可能存在8個N-糖基化位點，分別位于氨基酸的79，102，172，205，233，247，321，417位；該蛋白還存在41個潛在的磷酸化位點，包括19個Ser，15個Thr和7個Tyr(圖7)。

2.4 系統進化樹分析

利用 Mega 6.0軟件構建物種間分子系統進化樹，其中，人與獼猴聚為一類，灰雁、山羊和原雞聚為一類，不同種屬鼠聚為一類，鯉魚、斑馬魚與其他物種的遺傳距離較遠，綿羊與牛，水牛的遺傳距離較近(圖8)。

2.5 CD36基因在綿羊在7個組織及不同直徑卵泡中的表達譜檢測

通過實時熒光定量PCR檢測了CD36基因在5頭阿勒泰羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢以及不同直徑卵泡中表達變化。結果發現CD36基因在7個組織中都有表達，其中在心臟、卵巢等中高表達，在脾臟、肝臟和脾臟中等表達，在肌肉中低表達。其中心與肺中CD36表達量差異顯著(P<0.05)。在不同直徑卵泡中CD36總體表達量較低，其中中卵泡中CD36表達量最高，大卵泡次之，小卵泡中表達量最低，其中小卵泡與心表達量差異顯著(P<0.05，圖9)。

圖6 綿羊CD36蛋白二級結構分析Fig.6 Secondary structure analysis of CD36 protein in sheep

圖7 CD36蛋白存在的N-糖基化和磷酸化位點Fig.7 N-glycosylation and phosphorylation sites in CD36 protein

圖8 NJ法構建系統進化樹Fig.8 Phylogenetic tree constructed by NJ method

圖9 CD36基因在綿羊組織中表達情況Fig.9 Tissues expression profile of CD36 gene in sheep

3 討 論

卵母細胞的成熟離不開卵泡液和顆粒細胞，卵泡液是前者發育成熟的重要場所，而顆粒細胞分泌的蛋白和激素則調節卵母細胞的發育[12]。CD36又稱脂肪酸移位蛋白，是一種糖基化蛋白，可以結合多個配體，介導不同的生物學過程。 如CD36結合血小板反應蛋白1(TSP-1)通過抑制NO/cGMP信號途徑抑制血管生成[13]；CD36能在低密度蛋白(LDL)氧化過程中通過識別氧化磷脂(oxPLs)調節細胞攝取氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)[14]；在作為脂肪酸移位酶時，CD36同長鏈自由脂肪酸結合且有助于后者轉運至細胞內[15]。

研究表明，CD36在多種動物卵巢組織中表達且對卵泡發育有一定作用，如敲除CD36基因的小鼠，卵巢上表皮生長因子(VEGF)和其受體VEGFR-2表達均上調，同時排卵前卵泡數量顯著增加，黃體數量卻顯著降低[16]。CD36在大鼠竇狀卵泡早期和黃體期的顆粒細胞中均有表達[17]。隨著牛卵泡直徑的的增大，卵泡液中的CD36蛋白含量逐漸降低，同時在卵巢黃體形成過程中，CD36的下調有助于黃體上血管爆發式生長[18]。作為一種存在于多種細胞中的跨膜蛋白，近年來CD36在腫瘤中的表達與預后關系研究中較多，已經明確的是CD36調節多種功能：參與血管生成，動脈粥樣硬化、炎癥和脂質代謝[19-21]。在FSH超排處理羔羊和成年羊后，比較分析轉錄組數據推測，CD36可能在綿羊卵泡發育中具有調控作用。

本研究通過PCR擴增獲得CD36 基因CDS區序列。與NCBI上的預測序列對比發現一致。系統進化樹分析表明綿羊與牛，水牛的遺傳距離較近。將克隆到的核苷酸序列及翻譯成的氨基酸進行生物信息學分析發現，CD36蛋白分子量約為52.8 ku，整體來看親水性區域大于疏水性區域。對其跨膜結構和信號肽進行分析后發現，CD36蛋白存在2個跨膜結構區，在氨基酸的1～20位有一個信號肽。若蛋白質序列含有跨膜區表明其可能是以膜受體的形式發揮作用，也可能是定位于膜上的錨定蛋白或離子通道蛋白，信號肽則是引導新合成的蛋白質向分 泌通路轉移的短肽鏈。故本研究的結果表明，CD36蛋白蛋白可能是以膜蛋白的形式發揮其生物學作用。糖基化和磷酸化都是生物體內蛋白質翻譯后重要的修飾方式，通過在線軟件分析后發現，CD36蛋白可能存在8個N-糖基化和41個潛在的磷酸化位點。結果表明CD36蛋白在翻譯后中有豐富的修飾。

研究CD36基因在綿羊各個組織中的表達和分布，對進一步了解該基因的蛋白表達定位、作用的靶組織、及可能作用的功能部位均有重要意義。研究表明，CD36在小鼠，大鼠，牛等動物的各個組織中均有表達[22-24]。但在綿羊各個組織中的表達和分布報道較少；CD36基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢這7個組織中都有表達，在心臟、卵巢等中高表達，在脾臟、肝臟和脾臟中等表達，在肌肉中低表達。表明CD36 基因具有廣泛的組織表達特征，在綿羊生長過程中可能存在廣泛的生物學作用。不同卵泡直徑卵泡中CD36表達量存在差異，其中CD36 在直徑為3～5 mm卵泡中表達量最高，在直徑< 3 mm卵泡中表達量最低。這在一定程度上反映了CD36 基因可能在綿羊卵泡發育中具有重要作用。本研究初步探討了CD36 基因的結構和功能，但該基因在卵泡發育過程中的作用和機制需進一步探討。

4 結 論

本研究利用PCR擴增和克隆測序獲得了CD36基因CDS全長為1419 bp，共編碼472個氨基酸。CD36蛋白為脂溶性親水蛋白，具有1個跨膜螺旋結構，在氨基酸1～20位存在信號肽，存在8個N-糖基化和41個潛在的磷酸化位點，包括19個Ser，15個Thr和7個Tyr。系統進化樹分析顯示，綿羊與牛的親緣關系較近，與人、小鼠和雞等禽內親緣關系較遠。檢測不同組織和不同直徑卵泡中CD36 基因發現：心與肺和小卵泡中CD36 表達量差異顯著(P<0.05)，在不同直徑卵泡中總體表達量較低。