番茄果實成熟過程中SlSWEET7a的功能分析

程杰，張新圣，李安琪，姜晶

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番茄果實成熟過程中的功能分析

程杰，張新圣，李安琪，姜晶

（沈陽農業大學園藝學院/設施園藝省部共建教育部重點實驗室/遼寧省設施園藝重點實驗室，沈陽 110866）

【目的】SWEETs（sugars will eventually be exported transporters）是一種糖轉運蛋白，參與植物生物進程，對植物生長發育、響應各種脅迫、宿主-病原體的互作發揮作用?？寺》?，通過構建沉默和過表達載體，研究其在糖的轉運過程中的作用，為探索SWEETs在植物果實發育過程中的功能提供理論依據?！痉椒ā恳訫icro-Tom（）番茄為試材，利用RT-PCR技術從果實中克隆的cDNA全長842bp，進行生物信息學分析，并利用MEGA6.0構建擬南芥進化樹，與SlSWEET7a進行蛋白序列同源性分析；利用實時熒光定量PCR技術探明其在果實發育時期的時空表達特征分析，并構建基因的沉默和過表達載體，通過農桿菌介導的果實注射法進行瞬時表達檢測構建載體的表達效率；然后進行番茄的遺傳轉化，獲得T1代轉基因株系，利用實時熒光定量PCR技術檢測綠熟期果實的表達，通過高效液相色譜法檢測轉基因果實和葉片中糖組成與含量的變化?！窘Y果】SlSWEET7a蛋白結構是由7個跨膜結構域構成的。同源性比對分析結果顯示，SlSWEET7a與擬南芥AtSWEET6和AtSWEET8序列同源性較高，都屬于SWEETs家族的CladeⅡ。番茄果實各部位的表達分析顯示，在綠熟期果柄、果實維管束相對表達量最高，轉色期和紅熟期相對表達量較低。構建沉默（S7a）及過表達載體（OE7a）在番茄果實的瞬時表達，發現OE7a樣品果實中的表達量是未注射果實的6倍，其表達量明顯上調，與對照相比，S7a樣品果實中明顯下調了5倍。在番茄中的遺傳轉化中卡那霉素抗性篩選獲得10株可能的超表達T0代植株，PCR鑒定得到了超表達8株；沉默株系經除草劑篩選，獲得14株，PCR檢測得到10株沉默株系。T1代植株的實時定量分析顯示，過表達植株發生轉基因沉默現象，表達量顯著低于正常植株，而沉默植株表達量也降低，說明獲得的過表達植株也發生了基因沉默。果糖、葡萄糖和蔗糖含量測定結果表明，降低番茄中的表達，植株成熟葉片和綠熟期果實中果糖、葡萄糖和蔗糖含量均高于對照，尤其是葉片中蔗糖含量顯著高于對照，這說明對細胞中蔗糖的易化擴散起著重要作用?！窘Y論】SlSWEET7a對葉片中蔗糖向源組織韌皮部的裝載及果實果柄、維管束的運輸、卸載起重要調控作用。

番茄；SWEET7a；糖轉運；載體構建；表達分析

0 引言

【研究意義】植物的碳水化合物在源器官（成熟葉片）中合成，主要以蔗糖的形式通過韌皮部進行長距離運輸，然后將這些不同的化合物運輸到庫器官（幼嫩葉片、根尖、果實）來維持異養代謝和生長[1-2]。糖的代謝和分配在調節植物生長發育和植物響應生物和非生物因子中發揮著重要的作用[3]。番茄作為世界性范圍種植的茄果類蔬菜，具有非常高的經濟價值，其果實含糖量對風味和品質有著重要影響，并且直接影響了商品番茄及其番茄加工產物的經濟價值和營養價值。在植物的生長發育過程中，來自SWEET家族的糖轉運蛋白能調節糖的運輸，影響果實糖的積累。因此，研究番茄對蔗糖的轉運及其調控機理對于人們利用調控手段促進果實糖分積累、改善果實品質具有重要的理論意義?！厩叭搜芯窟M展】SWEETs是一類新發現的糖轉運蛋白，具有7個跨膜結構域，廣泛存在于原核生物、人類、植物以及動物中，擬南芥有17個SWEET家族成員，水稻有21個家族成員，番茄有29個家族成員[4-6]。系統進化樹分析植物SWEET基因家族有4個分支，分別為CladeⅠ、CladeⅡ、CladeⅢ和CladeⅣ。其中CladeⅠ（SWEET1—SWEET3）作為己糖轉運蛋白，主要轉運葡萄糖；CladeⅡ（SWEET4—SWEET8）主要作用是轉運葡萄糖；CladeⅢ（SWET9—SWEET15）主要轉運蔗糖；CladeⅣ（SWEET16—SWEET17）是一種液泡膜轉運蛋白，主要轉運果糖[7]。SWEETs作為糖轉運蛋白參與不同組織和器官中糖類的交換和運輸，對植物花器官、花蜜分泌和花粉的發育起著重要的作用[4]。如、、和參與生殖器官的發育，與花粉發育和花蜜分泌進程有關[8-11]。在花器官的表達部位不同，擬南芥和主要在雄蕊中表達，主要在花瓣中表達；水稻在圓錐花序和花藥中表達[12-14]。、和，在擬南芥的種子發育中表現出特異性時空表達模式，它們的三突變體顯示出嚴重的種子缺陷，包括胚乳發育延遲、種子重量減少和淀粉含量降低，在種子成熟期表現出明顯的表型[8,15]。水稻中的RNA干擾會導致花粉發育不良，進而引起雄性不育，降低穎果中的淀粉含量[16]，導致種子表面褶皺，重量減少。的突變體植株后代呈現種子變小，部分表型生長推遲[17]。在玉米和水稻種子灌漿期和負責己糖跨基部的胚乳轉換層進行轉運[18]；而擬南芥調節糖從源到庫的運輸，受到抑制會降低源器官的糖含量[19]。水稻參與半乳糖的轉運，其過表達會導致半乳糖代謝機制發生改變，從而引起植株生長延遲、根長變短[20]。水稻和擬南芥等在花器官和特定發育階段表達，參與單糖和二糖的轉運，這表明各自在調控植物生殖生長過程發揮不同的作用?！颈狙芯壳腥朦c】目前，雖已在擬南芥和水稻花器官和種子方面鑒定了SWEETs部分成員的生理功能，對調控作物產量形成中碳素分配具有重要意義，但在以果實作為糖積累器官的重要蔬菜作物-如番茄上有關SWEETs的相關報道較少。前期研究發現在果實發育時期尤其是綠果期大量表達，在其他部位表達量極低[6]。相比較植物源端韌皮部裝載和運輸途徑的研究，尚無SWEETs蛋白在番茄果實庫器官中介導蔗糖供給與代謝積累的生理功能和調控機理報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過轉基因技術獲得沉默和過表達植株，在對的表達量與果實中糖的分析基礎上，探究轉運糖的作用機制，進一步了解的功能，有助于為番茄果實品質的改良提供參考。

1 材料與方法

試驗于2015年9月至2017年12月在沈陽農業大學設施園藝省部共建教育部重點實驗室進行。

1.1 試驗材料

供試番茄品種為Micro-Tom（），試材取自沈陽農業大學蔬菜分子生物學番茄課題組。所用菌株和質粒：大腸桿菌菌株DH5α（TARATA，Japan）、農桿菌菌株LBA4404（TARATA，Japan）、具有氨芐霉素（Amp）抗性的pENTR/D-TOPO（Invitrogen，USA）質粒、具有壯觀霉素（Spe）抗性的pB7GWIWG2(I)（Invitrogen），含有篩選標記基因Ⅱ新霉素磷酸轉移酶基因卡那霉素（Kan）抗性的pBI121質粒。

1.2 番茄SlSWEET7a全長的獲得

根據NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的cDNA序列用Primer Primer 5軟件設計擴增特異引物。以Micro-Tom番茄果實為試驗材料，利用RNAprep pure Plant Kit試劑盒（TIANGEN）提取總RNA，利用FastKing RT Kit（With gDNase）反轉錄試劑盒（TIANGEN）將RNA反轉錄為cDNA。PCR反應程序為98℃30 s；98℃10 s，50℃30 s，72℃30 s，35個循環；72℃5 min。

1.3 SlSWEET7a表達載體的構建及農桿菌轉化

1.3.1 超表達載體構建 利用正向F引物（5′-CCCCCGGGACATAGCTATGACTTTTAATAG-3′）和反向R引物（5′-TGAAAAACAGAAGGCCCAA T-3′）進行PCR。反應程序為98℃30 s；98℃10 s，50℃30 s，72℃30 s，35個循環；72℃5 min，4℃10 min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的條帶進行膠回收純化產物和pBI121質粒用限制性內切酶Ⅰ和HⅠ進行雙酶切，即30℃30 min；85℃15 min。將兩者用T4連接酶進行連接，通過熱激法轉化大腸桿菌DH5α，在含有卡那霉素的LB平板上進行培養，挑取單一、大小合適的菌落于含有卡那霉素的LB液體培養基中，測序成功后用TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit試劑盒（TIANGEN）提取重組質粒。

1.3.2 沉默載體構建 根據的特異性序列，設計S7a-F引物（5′-CACCTGATGCCTACATTCT CGCACC-3′）和S7a-R引物（5′-TCCTTTAGCCTCTC TTGCTGCC-3′）進行特異片段擴增，反應程序為98℃30 s；98℃10 s，60℃15 s，72℃30 s，35個循環；72℃5 min，4℃10min。獲得的PCR產物利用Gateway技術與中間載體pENTR/D-TOPO連接，形成pENTR/D-TOPO–SWEET7a載體，測序鑒定正確后與終載體pB7GWIWG2（Ⅰ）進行LR反應。轉化獲得重組質粒。

1.3.3 農桿菌的轉化 采用液氮凍融法轉化農桿菌。將構建好的pBI121-35S-和pB7GWIWG2（Ⅰ）-35S-質粒轉入到農桿菌感受態LBA4404中，分別涂在含有50 mg?L-1Kan和25 mg?L-1利福平（Rif）與75 mg?L-1壯觀霉素（Spe）和25 mg?L-1Rif的YEB固體培養基中28℃培養20 h，然后在搖箱中以220 r/min搖到OD600=0.6。菌液測序成功后用于番茄的遺傳轉化。菌液儲存在50%的甘油中，-80℃保存備用。

1.4 過表達載體和沉默載體的瞬時表達

采用農桿菌介導的果實注射法進行瞬時表達分析，取Micro-Tom綠熟期果實，用一次性注射器吸取1 mL分別含有過表達載體和沉默載體的菌液緩慢注入果實中，黑暗條件下培養24 h后，在光照下培養3 d后進行取樣和果實總RNA提取，最后進行qRT-PCR分析的表達量。

1.5 番茄的遺傳轉化

參照Guo等[21]建立的番茄遺傳再生體系，采用葉盤法將沉默和過表達載體利用農桿菌介導分別轉化Micro-Tom番茄。將無菌番茄子葉切成0.5 cm2的小塊，正面朝下置于預培養基上（MS+15 g?L-1蔗糖+7 g?L-1瓊脂），25℃暗培養2 d后，將預培養的外植體浸入用MS液體培養基稀釋的農桿菌懸浮液中5 min（浸染濃度OD600=0.6），用無菌濾紙吸去外植體表面多余菌液，放置共培養基（MS+30 g?L-1蔗糖+7 g?L-1瓊脂+20 mg?L-1乙酰丁香酮）中，暗培養2 d；然后轉入生芽培養基（MS+30 g?L-1蔗糖+7 g?L-1瓊脂+ 1 mg?L-16-芐基腺嘌呤+0.2 mg?L-13-吲哚乙酸）中25℃，1 800 lx光強的條件下培養兩周后，再轉入新的生芽培養基繼代培養；待培養45天左右，轉化的抗性芽長至2—3 cm時，將芽切下轉入生根培養基（MS+30 g?L-1蔗糖+7 g?L-1瓊脂+0.05 mg?L-1α-萘乙酸）中誘導生根，將生根良好的T0代植株移到營養液中（山崎配方）遮蔭保濕，煉苗3 d，然后將植株種植到基質中，放置25℃，1800 lx光強，16 h光照/8 h黑暗的光照培養室中生長。

1.6 轉基因植株的分子檢測

采用DNAsecure Plant Kit試劑盒（TIANGEN）提取轉基因植株成熟葉片總DNA。沉默陽性植株鑒定以表達載體pB7GWIWG2（I）的除草劑抗性基因為篩選標記基因，通過設計Bar-F（5′-GAAGTCCAGCT GCCAGAAA-3′）和Bar-R（5′-CACCATCGTCAACCA CTACAT-3′），進行PCR檢測，PCR反應程序為94℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，35個循環；72℃5 min。過表達陽性植株的鑒定利用pBI121載體上的標記基因設計引物，用Kan-F（5′-GT CATACCACTTGTCCGCCCT-3′）和Kan-R（5′-GACC ACCTATGATGTGGAACGGGAAAA-3′）引物對過表達植株進行PCR鑒定，PCR反應程序為94℃5 min；94℃30 s，59℃32 s，72℃1 min，35個循環；72℃5 min。野生型植株作陰性對照。取PCR反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測儀檢測。

1.7 糖含量的測定

取0.5 g鮮樣采用液相色譜測定法對T1代轉基因植株的綠熟期果實及葉片進行果糖、葡萄糖和蔗糖3種糖的測定[22]。液相色譜儀（Waters e 2695，USA）測定條件為進樣溫度35℃；流速1.0 mL?min-1；柱子（Previl Carbohydrate ES 5u）；蒸發光散射檢測器（Alltech ELSD2000ES）。

1.8 RNA提取、反轉錄及實時熒光定量PCR分析

利用天根生化科技有限公司的RNAprep pure Plant Kit試劑盒（TIANGEN）試劑盒提取總RNA，采用PrimeScriptTMRT反轉錄試劑盒（TaKaRa，大連，中國）合成cDNA。根據的全長序列，利用Primer Primer 5軟件設計引物（-F：5′-TG ATGCCTACATTCTCGCACC-3′和-R：5′-TCCTTTAGCCTCTCTTGCTGCC-3′；內參引物Actin-F：5′-TGTCCCTATTTACGAGGGTTATGC-3′和Actin-R：5′-AGTTAAATCACGACCAGCAAGA T-3′）。實時熒光定量PCR利用TransStart Tip Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech，北京，中國）試劑盒，儀器為BIO-RAD IQ5，使用TIANGEN生物公司的Super Real MasterMix（SYBR Green）試劑盒，反應體系為2×SYBG Green Mix 9 μL、cDNA 2 μL、正向引物F1 μL和ddH2O 8 μL。qRT-PCR反應程序為95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，68℃15 s，40個循環。用2-ΔΔCt方法進行數據分析。

2 結果

2.1 SlSWEET7a的生物信息學分析

SlSWEET7a在NCBI中的蛋白編碼是LOC101246848，由254個氨基酸構成，如圖1所示的SlSWEET7a蛋白跨膜結構域圖，圖中藍色線代表細胞質定位，粉色線代表質外體定位，紅色線段代表跨膜結構域，從圖1可看出SlSWEET7a蛋白結構是由7個跨膜結構域構成的，跨膜結構域以外的區域較短。

將番茄與擬南芥SWEETs家族成員進行同源性分析（圖2），可看出與—同源性較高，研究表明、和具有雙向葡萄糖運輸能力，屬于CladeⅡ。的功能與—功能相似，可預測主要作為單糖轉運體行使功能，可能在番茄的果實發育及成熟過程中發揮作用。

2.2 SlSWEET7a的組織特異性表達

提取番茄綠熟期、轉色期、紅熟期果實的果柄、萼片、果皮、中果肉、膠質胎座、維管束、心室隔壁部位的RNA，反轉錄cDNA后，以管家基因為內參基因，對其組織特異性表達進行qRT-PCR檢測（圖3）。在綠熟期的果實維管束中的表達量最高，較對照明顯上調了3倍；果柄中的表達量也上調，其中在萼片中的表達量最低，其他部位的表達量顯著下調。轉色期果實在心室隔壁的表達量最低。紅熟期果實與轉色期的表達模式相似，其他組織的表達量都顯著低于根部，在果皮的表達量最低。

藍色線代表細胞質定位，粉色線代表質外體定位，紅色線段代表跨膜結構域

……：SlSWEET7a所處進化樹中位置，AtSWEET：擬南芥SWEET；SlSWEET：番茄SWEET

2.3 SlSWEET7a表達載體的獲得

2.3.1過表達全長的PCR擴增及過表達載體檢測 根據已獲得的cDNA全長，設計過表達引物擴增（圖4），獲得842 bp的目的片段，通過膠回收純化目的片段，純化產物經測序得到的序列用NCBI軟件進行Blast分析，與cDNA全長完全吻合。然后將測序匹配成功的產物和pBI121質粒分別用限制性內切酶Ⅰ和HⅠ進行雙酶切，進行連接反應，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，取菌液進行PCR擴增鑒定（圖4），含有目的片段的菌液進行測序，鑒定成功的菌液提質粒，重組質粒命名為pBI121-35S-。構建好的過表達載體轉入農桿菌LBA4404中，用于轉化番茄。

每組數據進行3次試驗重復，采用Statistics 17.0軟件分析。*代表差異顯著性（p＜0.05）。下同

M：DNA Marker 10000；1：SlSWEET7a的PCR產物；2：過表達載體菌液PCR擴增產物

2.3.2 沉默全長的獲得及沉默載體檢測 根據已知序列全長，按照RNA干擾原理設計沉默引物，進行沉默目的片段PCR擴增（圖5-A）。采用Gateway技術構建沉默載體，LR反應后轉化大腸桿菌DH5α感受態，菌液PCR驗證正確（圖5-B）進行測序，測序片段比對成功的菌液提取質粒為pB7GWIWG2（Ⅰ）-35S-，進行農桿菌的轉化。

M：DNA Marker 2000；1：PCR擴增產物；2：沉默載體菌液PCR產物

2.4 番茄SlSWEET7a超表達載體及沉默載體的瞬時表達分析

采用瞬時表達的方法對構建的沉默及過表達載體的效率進行初步探究，以未注射果實為CK、OE7a和S7a果實分別是注射了含有超表達載體pBI121-35S-和沉默載體pB7GWIWG2(I)- 35S-的農桿菌菌液。注射3 d后提取注射果實總RNA反轉成cDNA進行qRT-PCR（圖6）。以未注射果實的相對表達水平為對照，發現OE7a樣品果實中的表達量是未注射果實的6倍，其表達量明顯上調，S7a樣品果實中與CK相比明顯下調了5倍。綜上所述，構建的沉默和過表達載體能夠引起在番茄果實中的表達變化，可用于進一步的遺傳轉化。

2.5 番茄轉基因材料的獲得和鑒定

過表達和沉默轉基因番茄植株的獲得（圖7），分別經含有載體抗性基因和的培養基篩選，獲得10株可能的超表達植株，14株沉默植株。

對篩選出的轉基因植株進行PCR鑒定。結果表明，轉基因植株均擴增出與陽性對照大小一致的目的片段（圖8-A和圖8-B），經測序鑒定正確，而陰性對照（未轉化植株）未擴增出任何條帶。初步確定目的基因已整合到番茄基因組中，獲得過表達植株8株，沉默植株10株。

CK：對照；OE7a：過表達植株；S7a：沉默植株。每組數據為3次重復平均值

a：種子發芽；b：共培養；c：選擇培養/生芽培養；d：生根培養；e：煉苗；f：移栽

A：1：陽性對照，2：陰性對照，3：過表達植株；B：1：陰性對照，2：陽性對照，3：沉默植株。M：Marker

2.6 轉基因番茄T1代綠果期的實時熒光定量PCR分析

前期試驗結果表明番茄在果實綠熟期表達量最高。因此，對于獲得的T1轉基因植株分別提取綠熟期果實的總RNA，進行實時熒光定量PCR分析（圖9）。以正常植株CK的表達量為對照，過表達植株7a-1、7a-2的表達水平均顯著低于對照，分別比對照下降13.78倍和4.05倍；沉默植株7a-3、7a-4、7a-5與對照相比表達量降低，分別降低4.64、1.20和2.21倍。進一步驗證了前面篩選獲得的轉基因植株是陽性植株，依據實時定量分析結果，本研究獲得的過表達株系均發生了轉基因沉默現象。

CK：對照，7a-1和7a-2為過表達植株；7a-3、7a-4和7a-5為沉默植株。每組數據為3次重復平均值

2.7 T1代轉基因植株中糖的測定

植物成熟葉片作為“源”，其同化的光合產物除一部分用于自身代謝外，主要以蔗糖的形式通過韌皮部輸送到果實等庫組織中貯藏和利用。作為SWEETs家族CladeⅡ成員，主要參與單糖的運輸。如表1所示，過表達植株7a-1和7a-2成熟葉片中果糖、葡萄糖和蔗糖含量較對照均升高；沉默植株7a-3、7a-4、7a-5葉片果糖含量提高1.1—9.2倍；7a-3和7a-5葡萄糖水平分別高于對照的9.2和1.1倍，而7a-5則無明顯變化；蔗糖含量均較WT提高2.5—11.7倍。而番茄作為肉質果實，在果實發育過程中發揮著重要的作用，因此，果實中的糖濃度可以表現出SlSWEET7a參與糖轉運的水平，由于在果實綠果期大量表達（圖3），測定綠熟期果實糖含量。在對照植株中（表1），綠果的果糖的含量為3.84 mg·g-1FW，過表達株系7a-1和7a-2的果糖含量較野生型高1.4和3.7倍，沉默植株7a-3和7a-5的果糖提高1.3和2.2倍，而7a-4沒有顯著改變；和果糖一樣，與WT相比，除了7a-4沉默株系無明顯變化，其他過表達和沉默植株的葡萄糖和蔗糖水平均顯著增加，分別升高了2.0—4.8倍和2.1—2.8倍。結果表明，過表達植株和沉默植株中果實和成熟葉片糖的變化趨勢一致，過表達植株發生了沉默現象，沉默能夠引起果實和成熟葉片果糖、葡萄糖和蔗糖的升高，特別是葉片中這三種糖的含量。

表1 T1代沉默和過表達轉基因植株綠熟期果實和葉片的糖含量

CK：對照；7a-1和7a-2為過表達植株；7a-3、7a-4和7a-5為沉默植株；FW：鮮重；每組數據進行3次試驗重復，采用Statistics 17.0軟件分析，不同字母代表差異顯著性

CK: Control; 7a-1 and 7a-2: overexpressing plants; 7a-3, 7a-4 and 7a-5: silencing plants; FW: Fresh weight; WT: Wild type. Data represent the mean±SE(n=3). Data are analyzed by SPSS Statistics 17.0. Means with different letters within a column indicate significant differences (least significant difference (＜0.05)

3 討論

研究表明擬南芥中SWEETs家族CladeⅡ的成員AtSWEET4、AtSWEET5、AtSWEET7具有雙向葡萄糖運輸能力，主要影響細胞中葡萄糖的轉運[15]。本研究中番茄SlSWEET7a與擬南芥中SWEETs的生物信息學分析表明SlSWEET7a與AtSWEET4—AtSWEET8具有較高的同源性。擬南芥中相關CladeⅡ的大多都在花器官中表達，參與了花粉的發育。在花粉的營養細胞中特異性表達，尤其是在花粉成熟期高效表達，而在花粉發育時期能優先表達[9,23]。，也被稱為，在植物花藥及花粉壁的發育時期發揮作用[24]。水稻中相關的在葉片和根莖部的生長區及萼片部位表達，對其頂端發育有著調控作用[25]。葡萄中的在其花中表達量最高，它的表達量隨著葡萄漿果的成熟也隨之升高[26]。本研究中番茄果實的時空表達分析中發現在番茄果實綠熟期高水平表達，說明其對果實發育起著調控作用，與其生物信息學分析結果一致。從不同部位表達來看，在果實維管束和果柄表達量最高。果柄和果實維管束都屬于韌皮部疏導組織，在這兩個部位大量表達說明該基因有可能影響糖從源器官運輸到庫器官的易化擴散。果實的轉色期和紅熟期，表達量都很低，可能是家族其他成員或其他糖轉運蛋白發揮主要作用。

研究基因在植物中行使功能時常用到瞬時表達技術，將外源基因隨載體進入目標植物細胞中表達，2—3 d內即可檢測出外源基因的高水平表達量，而且農桿菌介導的瞬時表達是一種快速有效的分析基因表達的方法[27]。本研究通過對番茄果實進行瞬時表達處理，發現注射基因超表達及沉默載體的果實，其的表達量與未注射果實具有顯著性差異。含有過表達載體的農桿菌注射后導致綠熟期果實表達量顯著上調；而含有沉默載體的農桿菌注射果實后，表達量顯著下調，初步驗證了所構建載體能夠調控在番茄果實中的表達。在對番茄的遺傳轉化及陽性植株的PCR檢測T1代轉基因番茄材料（圖9）發現，過表達植株中表達量反而下降，顯著低于對照，這一結果是由于發生了轉基因的沉默現象。構建的過表達載體進行瞬時表達與穩定表達后對細胞內表達量的影響不同，這是由于瞬時表達過程中T-DNA并沒有轉化到基因組里，僅僅是短時期的在本代的一個階段表達，而穩定表達通過載體的左右邊界，插入整合到植物基因組里，可以隨基因組分裂進行遺傳。在這一過程中有可能受插入染色體位點、DNA甲基化及植物本身的調節機制影響[28]。由于在瞬時表達中檢測到高于對照果實的表達因此從沉默機制上，本研究中出現的過表達引起的轉基因沉默可能屬于轉錄水平的基因沉默。

目前，關于SWEET蛋白開展的研究結果顯示，它們在細胞與環境或細胞與細胞之間的糖類運輸過程中有重要作用[4,7-8,29]。如AtSWEET1是濃度依賴型的具有雙向低親和運輸葡萄糖的能力。AtSWEET11和AtSWEET12 則是蔗糖低親和的運輸載體，在擬南芥葉片維管束細脈韌皮部薄壁細胞中表達，參與韌皮部薄壁細胞中蔗糖向質外體的運輸[7]。水稻OsSWEET11和OsSWEET14也是蔗糖低親和的運輸載體, 它們也參與韌皮部蔗糖的裝載過程[4]。本研究對獲得的沉默T1代株系果實和葉片中糖含量的測定結果表明（表1），沉默后植株葉片和果實中果糖、葡萄糖和蔗糖含量高于對照，尤其是葉片中蔗糖含量顯著高于對照，說明SlSWEET7a可以轉運果糖、葡萄糖和蔗糖。這一結果與水稻中OsSWEET11和OsSWEET14、擬南芥AtSWEET11和AtSWEET12也可以轉運單糖和二糖的結論是一致的[7]。另外一些SWEET蛋白接收不同分子大小的底物，在糖易化功能方面SWEET基因家族成員之間存在冗余現象，而且對于一些依賴特定底物定位在質膜上的糖轉運蛋白單糖轉運蛋白（monosaccharides transporter，MST）和蔗糖轉運蛋白（Sucrose transporter，SUT/SUC）家族來說，它們的作用是未知的[30-31]，可能在SWEET7a的過表達和沉默之后，激活了這些轉運蛋白和其他SWEET的活性，對糖的轉運也發揮了作用，這需要進一步進行qRT-PCR驗證。另外，SWEET7a在爪蟾卵母細胞中的功能是轉運單糖葡萄糖，這可能在動物和植物中其轉運糖的表達方式不同[4,7]。

4 結論

SlSWEET7a與AtSWEET4—AtSWEET8具有較高的同源性，均屬于SWEETs蛋白家族CladeⅡ的成員，預測具有單糖的轉運功能。SlSWEET7a對糖從源器官運輸到庫器官的易化擴散起作用。對葉片中蔗糖向源組織韌皮部的裝載及果實果柄、維管束的運輸、卸載起重要調控作用。同時SWEET基因家族成員之間的糖易化功能存在冗余。

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（責任編輯 李莉）

Functional Analysis ofGene during Maturation of Tomato Fruits

CHENG Jie, ZHANG XinSheng, LI AnQi, JIANG Jing

(CollegeofHorticulture，ShenyangAgriculturalUniversity/Key Laboratory of Protected Horticulture, Ministry of Education/Key Laboratory of Protected Horticulture of Liaoning Province, Shenyang 110866)

【Objective】The SWEETs (Sugars Will Eventually Be Exported Transporters) is a kind of sugar transporters which are involved in plant biological processes and play key roles in plant growth and development in response to various stresses and host-pathogen interaction.was cloned and its function was analyzed to provide the theoretical foundation for exploring the function of SWEETs during fruit development in plant by constructing the silence and overexpression of.【Method】Using Micro-Tom () as a test material, the 842 bp full-lengthcDNA was cloned in fruits. The phylogenetic tree of SWEET proteins fromwas constructed by using MEGA6.0, and homology ofprotein sequences was analysed compared withRT-PCR was performed to analyse the spatiotemporal expression ofduring the fruits development periods. Thesilence vector and overexpression vector were constructed and transformed into tomato by-mediated genetic transformation. The efficiency of two vectors was examined by the transient expression ofs injection method. The expressions ofin T1generation transgenic green fruits were studied by quantitative PCR. The changes of sugar composition and content in transgenic fruits and leaves were detected by high performance liquid chromatography.【Result】The bioinformatics analysis of protein sequence showed that the SlSWEET7a is consisted of seven transmembrane domains. SlSWEET7a belongs to the CladeⅡof theSWEETs gene family, which was highly homologous to AtSWEET6 and AtSWEET8 ina. The analysis of spatiotemporal expression indicated thatexpression level was the highest at stalks and vascular bundles of mature green stage in tomato fruits, while the relative expression level was lower in breaker fruits and red ripping stage. The transient expression ofsilencing (S7a) and overexpression (OE7a) vector in tomato fruits was observed. The expression level ofin fruit of OE7a was 6 times higher than that of non-injected fruit, which was significantly up-regulated compared with control. However, the expression level ofin S7a was significantly decreased 5 times. Ten overexpression lines were obtained by kanamycin resistance screening, and eight overexpression lines were obtained by PCR. Fourteen silencing lines were screened by phosphinothricin and 10 transgenic silence lines were obtained by PCR. Real-time quantitative PCR analysis of theexpression in T1generation lines revealed that gene silencing occurred in overexpressed plants. The expression level of-overexpressing transgenic plants was significantly lower than that in wild plants, so did the silencing plants. Those results explained that the overexpressing plants also had the phenomenon of gene silencing. The determination of contents of fructose, glucose, sucrose showed that the silencing and overexpressing plants were higher than that of the wild type in the leaves and fruits after reducing expression ofin tomato. Especially, the sucrose content of leaves was significantly increased. This showed thatplays an important role in the facilitated diffusion of sucrose in cells.【Conclusion】plays an important role in regulating the loading of sucrose into the phloem of fruit tissue, the transportation and unloading of fruit stalks and vascular bundles.

tomato; SWEET7a; sugar transporter; vector construction; expression analysis

2018-01-23；

2018-03-06

國家自然科學基金（31372054）、沈陽市重點研發專項（17-147-3-00）

程杰，Tel：15909820516；E-mail：904135901@qq.com。通信作者姜晶，Tel：13998229283；E-mail：jiangjingcau@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.0011