潤楠過氧化物酶對水環境中雙酚A的清除

高艷芳，王楠， 王雨雪，肖強

(1. 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室(湖北民族學院)，湖北 恩施 445000；2. 湖北民族學院林學園藝學院，湖北 恩施 445000)

樟科(Lauraceae)潤楠屬(MachilusNees)植物，主要分布在亞洲東南部和東部熱帶、亞熱帶地區，約有100種，中國是其分布中心，記載有68種3變種，集中分布于長江以南各省(區)。潤楠屬植物是我國南方主要的經濟林木，大部分種類是熱帶及亞熱帶森林的表征種，在園林綠化、藥用、木材以及香料生產等方面占有重要地位[1-2]。潤楠(Machiluspingii)是國家Ⅱ級重點保護野生植物，其樹干挺直，具廣闊的傘狀樹冠，木材細致，味芳香，為優良的行道樹及庭院綠化樹種，莖、葉、皮均可入藥。我們前期研究木蘭科植物多樣性過程中發現，潤楠葉中具有較高過氧化物酶活性。

過氧化物酶(Peroxidase.POD.EC.1.11.1.7)是廣泛存在于各種動物、植物和微生物體內發揮清除過氧化氫作用的重要酶類[3-4]。因其本身結構的特殊性以及對環境的友好性，目前，POD已被廣泛應用于醫藥、農業、工業、環境等領域[5]。尤其是利用POD催化處理廢水中低濃度、有雌激素效應的酚類化合物的方法引起了人們的廣泛興趣，進而在相關技術上進行了有效的探索[6-10]。例如對大豆POD(Soybean peroxidase，SBP)用于酚類物質清除的條件優化、動力學特性和反應機理研究[11]，充分展現了POD對水體中微量酚類污染物的清除具有的較好應用前景。

環境雌激素是一類通過干擾生物體自身激素的分泌、合成、代謝進而影響機體正常生命活動的環境化學物質，具有隱蔽性、遷移性、蓄積性、持久性等特點，作用機制復雜、影響范圍廣泛，嚴重威脅人類健康和生存[12]。雙酚A(BispHenol A,BPA)化學名稱2,2-二(4-羥基苯基)丙烷，又名二酚基丙烷，主要應用于生產聚碳酸酯、環氧樹脂、聚砜樹脂、聚苯醚樹脂、不飽和聚酯樹脂等，是一種具有雌激素活性的環境內分泌干擾物，是世界生產量最大的化工原料之一，因其具有無色透明、耐用、輕便和防沖擊性特性，廣泛應用于液體容器、食品包裝及各類醫療設備等[13]。但BPA在使用過程中會從材料中釋放、泄漏出來，分布在大氣、土壤和水環境中，通過水和食物進入動物和人體內，并結合細胞中的激素受體，引起內分泌系統紊亂，致使有機體出現多種機能障礙，危害人類健康，其毒性研究已經受到學者的高度關注[14]。Li等人發現，接觸過多的BPA可能引發肥胖癥[15]。Ahmadkhaniha等人研究證實，尿液中含有BPA越多，發生糖尿病的概率就越高[16]。Chapalamadugu等人研究表明，BPA會干擾胎兒心臟的相關因子轉錄，可能會引發一系列的心臟疾病[17]。日前，也有研究表明BPA可以增加實驗動物的造血細胞的癌變和誘發睪丸腫瘤[18]，進一步的研究還證實BPA在小鼠身上表現為惡性乳腺癌致癌物質，并可能對人類也會產生相應的結果[19]。BPA無處不在，即使是低劑量染毒，也會造成嚴重的損傷；BPA具有生物富集、效用持久以及生理學響應濃度極低等特性，致使其在環境水體中很難通過傳統水處理技術去除。當前，對環境中BPA的消除主要采用生物降解法[20]、光催化的化學降解法[21]、活性炭吸附法[22]以及生物酶降解法[23]等方法，基于生物酶降解法具有高效、綠色、反應條件溫和等優點受到廣泛關注。

為研究潤楠成熟葉POD對環境水體中的污染物BPA的清除效果及實際應用前景，充分利用綠色資源，我們對潤楠成熟葉POD進行了初步分離，得到性質穩定的粗酶液，在此基礎上考察該酶對水體中的BPA去除效果及反應最佳條件。旨在探索一種利用POD處理含BPA廢水的低成本途徑，同時最大限度開發潤楠葉用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以湖北民族學院人工栽植的20年齡潤楠(Machiluspingii)，湖北民族學院林學園藝學院易詠梅教授鑒定，成熟葉為試驗原料。

1.2 試驗方法

1.2.1 潤楠POD粗提。取潤楠成熟葉，除去葉柄、主脈，稱取700g。按照1∶6料液比加入提取液進行提取，提取液含2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-P)、20%硫酸銨(W/V)以及20%的聚乙二醇(PEG2000(W/V))，4℃勻漿，置于冷凍離心機4℃、5000r/min離心45min，轉移至分液漏斗中靜置萃取2 h，取下相(鹽相)，再次離心，條件同上，進一步抽濾，濾渣丟棄，濾液轉移至透析袋中，采用蒸餾水透析除鹽，每8 h更換一次水，直至透析液用1% BaCl2檢測無沉淀產生為止(一般在有磁力攪拌器攪拌的情況下，更換3次蒸餾水即可達到除鹽效果)。脫鹽后的酶液冷凍干燥保存待用。

1.2.2 POD酶活性測定。參考Amako[24]等的方法并稍修改，測定體系為4mL，包括1mL 40mmol/L愈創木酚，1mL 40mmol/L H2O2，1.9mL 100mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 6.0)。加入0.1mL酶液后啟動反應，于波長470nm，30 ℃下記錄OD值變化。1個酶活性單位定義為測定條件下每分鐘OD470變化0.1所需的酶量。

1.2.3 蛋白含量測定。蛋白質含量測定采用 Bradford[25]染色法，以牛血清蛋白作標準蛋白。

1.3 BPA去除條件研究

研究最佳酶濃度時，檸檬酸緩沖液(50mmol/L，pH值6)，0.2 mg/mL的BPA溶液(后續實驗均使用此濃度)、100μmol/L H2O2，反應溫度25 ℃，設置酶濃度分別為50、100、150、200、300、500U/mL，之后對其它去除條件的研究，除變量外均采用此條件。研究最佳溫度時，設置不同的反應溫度分別為10、15、20、25、30、40、60℃恒溫水浴條件下，對BPA清除效果展開研究。設定pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、11.0的檸檬酸緩沖液(50mmol/L)，對BPA清除效果展開研究。設定粗酶液與H2O2摩爾濃度比為1∶0.5、1∶2、1∶5、1∶7.5、1∶12、1∶20，潤楠粗酶液對BPA清除效果研究。反應混合物置于恒溫水浴鍋中攪拌，加入1mL H2O2溶液啟動反應，反應體系共20 mL。于反應0min(未加過氧化氫時)、1、3、5、15、45、90、120、180min取1mL反應溶液，加入2mL甲醇終止反應，即實現潤楠葉對BPA的清除。加入100μL硫酸鋁鉀以終止反應，搖勻，過夜沉淀后5000 g離心10min。上清液過0.22μm濾膜后檢測BPA濃度。

1.4 分析方法

Agilent公司ZORBAX C-18(2.1×50mm, 1.8μm)色譜柱。流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，35%乙腈等度洗脫，柱溫25℃，體積流量0.2mL/min。ESI離子源負模式，干燥氣溫度350℃，流速10L/min；霧化器壓力45psig，毛細管電壓3500 V，毛細管出口電壓150V，錐孔電壓65V，采集速度1.5spectra/s，選擇離子(EIC)采集方式，選定的分子離子[M -H]-的質荷比為227(BPA)。

2 結果分析

2.1 最佳清除酶濃度確定

分別考察50、100、150、200、300、500U/mL的潤楠粗酶液濃度對BPA清除效果的影響。結果如圖1所示?？梢娫谕粫r刻，隨著反應體系酶濃度的升高，BPA最終剩余率不斷下降，在20min時，50U/mL酶濃度清除效果可達60%，500U/mL可達到完全清除。在90min左右大于50U/mL的任意酶濃度去除BPA的效率達99%以上。由此可以看出，潤楠POD對于催化去除BPA效果極佳，具有良好的應用前景。

圖1 不同酶濃度對潤楠葉過氧化物酶清除BPA的影響

2.2 不同溫度條件對去除BPA的影響

分別在10、15、20、25、30、40、60℃條件下，考察溫度對潤楠POD催化去除BPA的影響，結果如圖2所示?？梢姕囟葘τ诿盖宄鼴PA影響較小，在短時間內均可達到高效清除。在10～60℃范圍內3 h清除率可以達到99%，在25℃時清除效果極佳，表明該酶的熱穩定性良好，有益于實際運用。酶促反應對溫度具有高度敏感性，升高溫度既可加速酶促反應又可加速酶的變性失活。上述溫度條件下，潤楠POD受溫度影響很小，可在較低溫度和較高溫度下保持活性，具有很好溫度適應范圍。

圖2 不同溫度條件對潤楠葉過氧化物酶清除BPA的影響

2.3 pH對去除BAP的影響

設定pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、11.0的反應條件(50mmol/L)，考察不同pH對去除BPA的影響，結果如圖3所示?？梢?，pH值為4～7之間時，該酶促反應均無太大影響，在40min左右，對BPA的清除效果可達到99%。而pH值超出此范圍時，pH對反應影響較大， 顯著降低了對BPA的去除效率。上述結果表明，在酸性到中性條件下，潤楠POD具有良好的活性及穩定性，可以有效去除BPA。

圖3 不同pH值條件對對潤楠葉過氧化物酶清除BPA的影響

2.4 最佳清除H2O2/BPA摩爾濃度比比值確定

設定H2O2/BPA摩爾濃度比為1∶0.5、1∶2、1∶5、1∶7.5、1∶12、1∶20，考察不同H2O2/BPA比值對去除BPA的影響，所得具體結果如圖4所示。從圖4可以看出，在反應達到3 h時，在H2O2/BPA摩爾濃度比值為5～20時，BPA未能達到完全的清除，但均可達80%及以上。在比值為0.5時，3 h后清除率僅達60%，僅當H2O2/BPA摩爾濃度比值為2時，在3 h內去除率和去除反應速率隨著濃度比的增大而減小，3 h后可完全清除，確定H2O2/BPA最佳摩爾濃度為2倍。

結果顯示，不同的H2O2/BPA摩爾濃度比比值，對去除BPA有明顯的區別。主要因為H2O2既是POD的底物又是POD的失活劑。劉海峰等研究表明，H2O2作為氧化劑，其初始反應濃度的高低直接影響對底物的催化反應效果，H2O2的濃度小于20mM時，最終產物濃度與底物OPD濃度呈正比例關系，但當H2O2的濃度大于20mM時，最終產物濃度不再與底物OPD濃度呈正比關系，說明此時過量的H2O2使HRP發生了更復雜的失活作用[26]。

圖4 不同H2O2比例對潤楠葉過氧化物酶清除BPA的影響

3 結論與討論

POD是植物體內普遍存在的、活性較高的一種酶，它與植物代謝及抗逆性都有密切關系[27-28]。董金龍等[29]對金銀花過氧化物酶酶學性質研究表明，金銀花最適溫度是30℃，且該酶在10～40℃范圍內穩定性較好，最適pH和pH穩定性研究表明酶的最適pH為5，酶在pH小于4的酸性環境下酶活力下降，pH值在4～7范圍內有較好的穩定性。在本研究中，潤楠葉POD在pH4～7內穩定性良好，溫度在10～60℃范圍酶活性無明顯損失。與金銀花POD較為接近，說明潤楠POD具有優良的耐熱性，有利于實際生產利用。

Duarte-Vázquez等[30]等研究了蘿卜過氧化物酶(TP)對酚類物質的清除效果，結果顯示，在pH4～8，溫度25℃，H2O2濃度為0.8mmol/L條件下，經過3 h，1.28U/LTP對0.5mmol/L對BPA的清除效果可達85%，在本研究中，在pH4～7，溫度10～60℃，H2O2/BPA摩爾濃度比比值為2的條件下，經過3h，潤楠POD對0.2 mg/mL BPA清除率可高達99%及以上。與上述結果類似，潤楠POD具有較寬的pH范圍及良好的溫度適應性，表明潤楠POD具有工業應用的前景。

經過雙水相萃取，從潤楠成熟葉片中分離得到一種活性較高、性質穩定的POD。潤楠POD清除BPA的最佳條件為酶濃度為300U/mL ，pH值6，接近中性，溫度25℃ ，H2O2/BPA摩爾濃度之比為2時，其清除率達 95% 以上，最高可達99.9%的去除率。實驗數據充分顯示潤楠POD具有較寬的pH和溫度適應范圍以及較高的去除率和抗有機污染能力，在酚類污染治理方面具有巨大潛力和商業價值。

在污水處理及污水循環利用的過程中，對含有BPA在內的廢水的控制和清除，是非常緊迫和必要的，酶處理技術因作為一種綠色經濟有效方法而值得探索研究，利用酶的催化氧化作用處理內分泌干擾物污染也是目前受到重視和看好的新興技術。該技術可有效降低污水中低濃度有毒有機污染物，對篩選更高效經濟的酶具有深遠意義。