胰腺癌患者臨床特征與異種移植模型的相關性*

張 賀 張彩勤 趙 勇 譚鄧旭 師長宏

(1.原沈陽軍區總醫院醫務部，沈陽 110015)(2.第四軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)

胰腺癌(Pancreatic cancer)是一種惡性程度很高的消化系統腫瘤。臨床患者治療效果十分有限，5年生存率低至6%，約20%的患者有手術機會，術后5年生存率僅為25%[1]。利用免疫缺陷小鼠建立胰腺癌異種移植(patient-derived xenograft，PDX)模型[2]，能夠很好地保持腫瘤的遺傳特性和異質性，使人們更進一步了解了胰腺癌的生物學特點，而且能夠針對不同患者開發個體化治療方案[3]。然而，胰腺癌PDX影響因素、成模規律及生長特性等機制問題尚不清楚[4]。影響PDX成模的關鍵因素可能是認知胰腺癌的新視角。本研究通過分析62例胰腺癌患者的臨床癥狀和腫瘤的病理學特征，探索與PDX成模率的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及福利倫理審查

6～7周齡SPF級雄性裸鼠，體質量22～25 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司 [SCXK(蘇)2016-0010] 提供。飼養于第四軍醫大學實驗動物中心SPF級屏障設施 [SYXK(陜)2014-001]。環境溫度23～25 ℃，相對濕度40%，12 h晝夜交替，飼料經輻照處理，飲用水經高壓滅菌處理，動物自由攝食和飲水。本研究動物實驗通過了第四軍醫大學實驗動物福利及倫理委員會批準，編號：14013。

1.2 患者信息及腫瘤病理特征

62例胰腺癌患者來自第四軍醫大學西京醫院(2015年4月至2016年4月)，確診為胰腺癌，并接受了根治性意向手術?；颊咝畔⒓澳[瘤標本的取得經過患者本人及家屬同意，并簽署知情同意書，建立患者信息、腫瘤特征及移植瘤模型三者相對應的數據庫，供分析研究。人體標本實驗通過西京醫院醫學倫理委員會的批準，批準編號：2015432。

1.3 試劑及藥物

基質膠由美國BD公司生產，DMSO購自Sigma公司，胎牛血清由浙江天杭生物科技股份有限公司生產，蘇木精和伊紅染色液購自北京雷根(Leagene)生物技術有限公司，組織基因組DNA提取試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司生產。

1.4 胰腺癌PDX模型的建立及傳代

將患者新鮮的腫瘤組織剪為3 mm3碎塊，混合適量的基質膠，利用穿刺針移植到裸鼠背部皮下，命名為P1代；移植瘤生長至1 000 mm3時，異氟烷麻醉小鼠，手術獲取腫瘤組織，在另一只裸鼠皮下進行傳代，命名為P2代，以此類推，傳代至P5代。記錄代際間隔時間(從皮下接瘤到移植瘤收獲的時間)；凍存各代腫瘤組織(凍存液成分為：10%DMSO+90%胎牛血清)，復蘇后觀察生長速率。取P5代瘤組織，利用試劑盒提取基因組DNA，送西京醫院司法鑒定中心進行STR基因分型檢測。

1.5 組織形態學觀察

取原發瘤及各代移植瘤組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.6 腫瘤組織CA19-9抗原檢測

將制備的組織切片經脫蠟后，弱酸性環境中微波修復抗原，封閉非特異性蛋白并消除內源性過氧化物酶活性，一抗CA19-9(1∶100)孵育過夜；加入二抗(羊抗鼠)，DAB顯色后蘇木精復染，酒精脫水、甲醛透明并封片；光學顯微鏡下觀察。

1.7 血清CA19-9的檢測

各代PDX模型心臟采血，5 000 r/min離心10 min，分離上層血清，送西京醫院檢驗科檢測CA19-9含量。

1.8 統計方法

2 結果

2.1 患者群體臨床特征、腫瘤病理特征與PDX模型的相關性

根據腫瘤植入狀態評估了實驗室接受到的62例患者樣本，建立PDX模型，總成模率為47%，見表1和表2。統計分析發現患者人口統計學或臨床特征與PDX成模率之間相關性不顯著，P>0.05；分析發現，是否接受輔助治療與PDX成模率相關性不顯著，P=0.258；腫瘤轉移情況、術后復發情況(術后復發統計數量為去除轉移患者數量)和手術類型(根據切除胰腺部位分為Whipple、middle、distal和total 4類)與成模率相關性不顯著，P>0.05?；颊吣[瘤的病理特征分析表明，腫瘤細胞的分化程度和生長位置與PDX成模率之間相關性不顯著，P=0.846、P=0.057；胰腺原發瘤的大小與PDX成模率之間存在顯著相關性，P=0.041；腫瘤細胞浸潤淋巴系統情況與PDX成模率之間相關性極顯著，P=0.001。相比之下，腫瘤細胞浸潤神經系統并未表明存在顯著的相關性，P=0.681。

表1 基于62例胰腺癌患者臨床特征和PDX模型相關性統計Table 1 the correlation of clinical features and PDXmodels based on 62 pancreatic cancer patients

注：Whipple：胰十二指腸切除術(pancreatoduodenectomy, PD)；middle：中段胰腺切除(middle segment pancreatectomy)；distal：胰體尾切除術(distal pancreatectomy, DP)；total：全胰切除術(total pancreatectomy, TP)

Note： Whipple：pancreatoduodenectomy; middle：middle segment pancreatectomy; distal：distal pancreatectomy; total：total pancreatectomy

注：組間比較差異性顯著，*P<0.05，組間差異性極顯著，**P<0.01

Note： comparison among groups significant difference，*P<0.05， comparison among groups extremely significant difference，**P<0.01

2.2 原發瘤與P1至P5代PDX模型移植瘤的一致性

2.2.1STR基因分型檢測：STR(short tandemrepeat)基因分型檢測所選取的16個位點具有種屬特異性，是從人類的23對染色體中所挑選的等位基因，多態性程度高。分析所選取的基因是由2～6個堿基構成一個核心序列，核心序列串聯重復排列，序列和重復次數決定多態性。在所選取的16個人類基因位點均檢測到信號，其人源性判定率為99.99%。

2.2.2腫瘤分化特征對比：HE染色后，對比原發瘤、P1至P5代PDX模型腫瘤分化特征(圖1 A)，不同分化程度的原發瘤經過5次傳代后，仍然能夠保持不同的分化程度。

2.2.3胰腺癌特異性抗原CA19-9免疫組化分析：原發瘤組織和P1代至P5代PDX模型移植瘤組織中胰腺癌特異性抗原CA19-9表達呈陽性，見圖1B；兩者CA19-9抗原表達無差異。

2.2.4血清中CA19-9的檢測結果：血清CA19-9含量是胰腺癌臨床診斷的重要指標，臨床檢測參考值為27 U/mL?；颊哐錍A19-9值與各代PDX模型血清CA19-9值均高于參考值，提示發生胰腺癌，見圖2。

圖1 患者與各代PDX模型分化特征(圖A)和特異性抗體CA19-9對比(圖B)(×20， scale bar=20 μm)Fig.1 Comparison of the differentiation and the specific antibody CA19-9 between patient’stumor (Fig.A) and PDX models (Fig.B)(×20， scale bar=20 μm)

圖2 患者與各代PDX模型的血清CA19-9對比Fig.2 Comparison of serum CA19-9 betweenpatients’ and PDX models

3 討論

人類癌癥的復雜性和異質性是建立臨床前動物模型不可避免的兩個難題。PDX模型能夠較好地保持親本腫瘤中大多數的關鍵基因和信號通路活性[5-6]，能夠更好地模擬患者基因學特征和病理學特征[7]。在胰腺癌研究中，臨床前和臨床研究的共同障礙是難以獲得足夠量的腫瘤組織，這一定程度上阻礙了深入研究胰腺癌的致病機理、生長規律及分子特征。Mattie等[8]建立胰腺癌PDX模型，經過多次傳代后，原發瘤的基因表達模式在PDX模型中得以維持，同時61%的患者原發瘤樣本建立了對應的PDX模型，成功預測了患者不良預后。Jun等[9]利用SCID(severe combined immune deficiency)鼠建立胰腺癌PDX模型，成模率為55.8%。本研究胰腺癌樣本量為62例，29例成功建立PDX模型，成模率為47%，略低于上述報道，推測可能與使用的免疫缺陷動物有關，上述研究使用的是免疫缺陷程度更高的SCID鼠，免疫缺陷或許能夠提高移植效率[10]。為了有效地利用原發瘤樣本，探索PDX模型的影響因素，本研究從患者臨床信息和腫瘤病理特征兩方面，統計分析了與PDX模型成模率之間的相關性，并驗證了原發瘤與5代PDX模型的一致性。

分析結果表明，患者的基本情況，年齡、性別、體質指數和血清CA19-9與成模率無顯著相關性；患者的既往病史，如是否患有糖尿病與成模率無顯著相關性；雖然，手術外的其他輔助治療在胰腺癌患者治療過程中越來越常見[11]，但是與成模率無顯著相關性；同樣，術式的不同、腫瘤轉移情況與成模率也無顯著相關性，與報道的胰腺癌PDX模型成模率相關性分析相一致[12]。評估腫瘤病理因素，同一原發瘤可能同時存在不止一種細胞分化狀態，造成腫瘤內部的不均一性，這也是腫瘤異質性的一種體現方式，以往觀點認為處于低分化程度的腫瘤細胞惡性程度高，對成模率影響較大；但是，本研究的結果表明無論腫瘤細胞處于何種分化程度對成模影響無顯著差異；推測不同分化程度的腫瘤細胞對新環境的適應能力才是PDX成模的影響因素。本研究中移植腫瘤的大小與成模率有顯著相關性，腫瘤>3.5 cm的成模率顯著高于腫瘤<2.8 cm的成模率。術后取得的原發瘤標本形狀不規則，無法用體積衡量，一般使用長度單位計量。有報道稱，腫瘤大小與異質性程度和腫瘤細胞代謝活性相關[13]，而且，腫瘤>3.5 cm是胰腺癌患者預后的獨立影響因素[14]。同時，本研究發現胰腺癌淋巴轉移情況與成模率顯著相關，表明淋巴轉移的腫瘤細胞更具有侵襲性和更高的代謝活性，對新環境的適應能力也更強，利用此類樣本建立的PDX模型成模率越高[15-16]。本研究并未統計標本離體時間與成模的相關性，原因是腫瘤標本的采集、運送過程到皮下接瘤全過程用時控制在4 h以內，沒有標本離體時間較長的情況發生。

研究報道，PDX模型會隨著傳代次數的增加，丟失了原發瘤的病理特征，失去了異質性特征[17]。PDX模型經過5～8次傳代后，發生突變的幾率增大。推測發生突變的原因是腫瘤適應異體生長環境而產生選擇性壓力導致的，或許由于原發瘤中存在低于可檢測范圍的亞克隆過度生長所致[18]。如果移植瘤和原發瘤的一致性程度不高，PDX模型就失去了對原發瘤的研究意義，基于PDX模型制定的個體化治療方案就失去了臨床效用。因此，我們對5代PDX模型進行了一致性分析，驗證了經過多次傳代后的移植瘤和原發瘤的一致性。

綜上所述，我們分析了胰腺癌患者的臨床特征和腫瘤病理學特征，探索影響PDX成模率的因素，發現原發腫瘤的大小和淋巴轉移情況是影響PDX模型成模的重要因素。下一步我們將針對影響腫瘤發生的相關分子進行機制研究，深入了解腫瘤大小及淋巴浸潤能力如何影響胰腺癌PDX成模率[19]。同時，擴大樣本量覆蓋更加廣闊的人群，以便研究胰腺癌PDX模型成模的普遍規律。