遼東灣毒害微藻潛在風險分布及環境關聯

宋 倫,吳 景,李 楠,杜 靜,王 昆,劉桂英,王 鵬

?

遼東灣毒害微藻潛在風險分布及環境關聯

宋 倫1,2,吳 景2,李 楠2,杜 靜2,王 昆2,劉桂英2,王 鵬1*

(1.哈爾濱工業大學環境學院,城市水資源與水環境國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150090；2.遼寧省海洋水產科學研究院,遼寧 大連 116023)

以18S rDNA V4區作為目標基因,利用自行設計的真核浮游植物鑒定引物V4(F/R),結合高通量測序技術,對遼東灣2014年四季海水中真核藻類多樣性進行了檢測.結果發現了遼東灣毒害藻類共29種,曾引發赤潮或褐潮的種類有19種,可導致魚類大規模死亡的有8種,主要為甲藻門.有18種疑似為遼東灣新記錄種,其中9種在中國海域未見報道;發現麻痹性貝毒(PSP)產毒藻8種,腹瀉性貝毒(DSP)產毒藻2種,產蝦夷扇貝毒素(YTX)產毒藻3種,神經性貝毒(NSP)產毒藻2種,溶血毒素(hemolysin)產毒藻13種,另外還有1種褐潮產毒藻(EPS).遼東灣檢出的毒害藻類中有8種自養型、1種異養型、20種混合營養型藻類.麻痹性貝毒、蝦夷扇貝毒素、溶血毒素在夏季風險較高,神經性貝毒在秋季風險較高,腹瀉性貝毒在春、夏季風險均較高,遼東灣東西兩岸是貝毒風險高發區.遼東灣春季水溫對YTX、NSP產毒藻影響顯著負相關;夏季COD、Oil、DIN、Pb、Cd對各產毒藻類影響顯著正相關;秋季各環境因子對各產毒藻類影響不顯著;冬季Zn、As、Oil、DIN對各產毒藻類影響顯著正相關,水溫對各產毒藻類影響顯著負相關,各產毒藻類與環境因子關聯性有待于進一步研究.

有毒微藻；貝毒；風險分布；環境關聯；遼東灣

貝類或魚類通過攝食有毒微藻等,經過生物累積和放大轉化為有機毒素,從而危及水產品質量安全[1].目前已發現有麻痹性貝毒(PSP)、腹瀉性貝毒(DSP)、神經性貝毒(NSP)、記憶缺失性貝毒(ASP)、蝦夷扇貝毒素(YTX),以及雪卡毒素(西加魚毒素, CTX)、刺尾魚毒素(MTX)、溶血毒素(hemolysin)等[2-5],另外還存在一些導致魚類大量死亡的藻類[6].由于檢測方法相對滯后,毒藻風險預警研究相對遲緩,因此全面篩查目標海域有毒藻類及其數量分布尤為重要[7].而傳統形態學鏡檢方法已不能滿足微型、微微型有毒藻類的檢測[8],高通量測序技術的發展極大地推動了小粒徑藻類的高效檢測研究[9-10],采用該技術,2014~2015年在遼東灣發現了褐潮致災種抑食金球藻()[6]和外來有害微藻擴散跡象[11].

遼東灣是渤海最大的半封閉式海灣,是海洋生物重要的索餌場、產卵場、越冬場和洄游通道,但多年來超負荷承載陸源污染,近岸海域富營養化嚴重,有毒有害赤潮、褐潮頻發,貝毒中毒事件時有發生[12-13].目前遼東灣有毒藻類傳統檢測方法只記錄了8種[14],作為有毒有害藻類風險研究背景數據極其匱乏,鑒于此,本研究采用高通量測序平臺,結合生物信息學方法,以18S rDNA的V4區為目標基因篩查了遼東灣真核有毒有害微藻種類[15],同時分析了其與環境因子的相關性,為貝毒風險預警研究提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 樣品采集、制備與質量控制

2014年在遼東灣海域網格化設置12個站位(圖1),分別于2014年5月(春)、8月(夏)、10月(秋)、12月(冬)采集表層海水1L.樣品首先經200 μm篩絹過濾去除大型浮游生物,然后用0.22 μm微孔濾膜收集真核浮游植物,最后將濾膜轉移至1.5mL無菌離心管中,置于-20或-80 ℃冷凍保存、運輸.站位選取主要依據《海洋調查規范》(GB/T 12763-2007)[16],主要考慮樣品的區域代表性和均勻性.

圖1 遼東灣采樣站位示意

同期進行海水的水溫(SST)、無機氮(DIN)[銨鹽(NH4+)、硝酸鹽(NO3-)、亞硝酸鹽(NO2-)之和]、活性磷酸鹽(SRP)、石油類(Oil)、化學耗氧量(COD)、重金屬汞(Hg)、鉛(Pb)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鎘(Cd)、砷(As)等指標的監測.調查、監測、質量控制方法均參照《海洋調查規范》和《海洋監測規范》(GB17378- 2007)[17]執行.

1.1.1 基因組DNA提取 采用CTAB法提取微微型浮游植物宏基因組,將濾膜剪碎置于1.5mL離心管中,加入500μL CTAB裂解液(2% CTAB; 100mmol/L Tris-Cl,pH值為8.0;1.4mmol/L NaCl; 10mmol/L EDTA)和1μL β-巰基乙醇,5~10μL蛋白酶K,55℃裂解1~1.5h;12000r/min離心5min,取出液體置于新的離心管中,用酚氯仿抽提2次后,取上清液,加入2倍體積預冷的無水乙醇,沉淀2~3h,保留沉淀,使用75%乙醇清洗沉淀,得到浮游生物基因組DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA濃度及純度,合格后置于-20℃冰箱保存備用.

1.1.2 18S rDNA可變區V4的PCR擴增 該研究應用的引物為自行開發的真核浮游植物18S rDNA的V4區基因擴增引物——V4(F/R).上游引物為V4-F序列5'-GCGGTAATTCCAGCT CCAATA-3',下游引物為V4-R序列5'-GATCCCCHWACTTT- CGTTCTTGA-3'[18].將引物連接適當的接頭送往上海生工生物公司進行合成. PCR反應體系為50μL,包括PCR Buffer 5μL、dNTP Mixture 8μL、上下游引物(10μmol/L)各2μL、模板DNA 2μL、Taq DNA聚合酶2.5U,加適量滅菌水.擴增反應均在PE 9700型PCR儀(美國PE公司)上完成,反應條件:94℃預變性3min;94℃變性30s,58℃退火45s,72℃延伸45s,共33個循環;72℃延伸5min. 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,將檢測合格的產物交由諾和致源生物信息科技有限公司,使用NEB Next? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina(New England Biolabs)建庫試劑盒進行文庫的構建,構建好的文庫經過Qubit定量(Thermo Scientific)和文庫檢測,合格后,使用Hiseq2500PE250模式進行上機測序.

1.2 數據分析

測序得到的原始數據使用FLASH軟件進行拼接,參照Qiime軟件質量控制流程將拼接后的序列經過截取、過濾得到有效數據.利用Uparse(http: //drive5.com/uparse/)對有效數據進行OTUs (Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類,采用RDP Classifier方法與SILVA數據庫(https: //www.arb-silva.de/,Version 108)對OTUs代表序列進行物種注釋[19].根據相關研究,粒徑相同的微藻序列數比例更接近于豐度比例[20],鏡檢同期水樣中出現的所有浮游植物,篩選同站位與分子鑒定毒害藻類粒徑大小相似的種類作為密度基準種類[13],通過序列數比測算潛在毒害藻類密度,相關公式:

式中:為某站某種毒害藻類密度,ind/L;為同一站位水樣中與某種毒害藻類粒徑大小相似的鏡檢藻類密度,ind/L;為某站位水樣中密度基準藻類的序列數;為某站位毒害藻類的序列數.

采用相對密度(RA)計算毒害藻類各季節數量相對比例:

式中:n為潛在毒害藻類在站的密度,ind/L;為統計單元的總密度,ind/L.

對上述公式計算、數據分析、方差檢驗、等值線繪制均通過Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0軟件完成.

2 結果

2.1 測序數據質量

通過IlluminaHiSeq 2500測序平臺進行PE250模式測序,所得原始數據使用FLASH軟件進行拼接,參照Qiime軟件質量控制流程,將拼接后的序列經過截取、過濾得到有效數據.每個樣品平均獲得77297條原始序列,經過拼接和質量過濾,每個樣品平均得到70604條序列,高質量數據占到91%以上,表明測得的數據準確可靠.各樣品測序結果見表1.

表1 有效序列數及OTUs數統計

2.2 OTUs聚類和物種注釋

為進一步分析表層海水樣品中物種組成多樣性信息,使用Uparse軟件對所有樣品的有效序列進行聚類分析,以97%的一致性將序列聚類成為OTUs種水平,每個樣品平均獲得378個OTUs,剔除原生動物OTUs數后,春、夏、秋、冬注釋到種的浮游植物種類分別為150、187、183、195.

2.3 毒害藻類種屬確定

采用RDP Classifier方法與SILVA數據庫對OTUs代表序列進行物種注釋,獲得各個分類水平OUTs的注釋信息,為了驗證結果的可靠性,將測序獲得的序列信息與NCBI數據庫中信息進行二次比對,獲得種水平信息,其NCBI中對應的序列號和相似度見表2.高通量測序獲得29種毒害藻類部分18S rDNA序列片段長度為380bp左右,通過NCBI Blast比對,在18S rDNA基因序列中對應的位置為489~ 956bp,此部分序列相似度為97%~100%,擬合度期望值(E-value)均為0.

表2 遼東灣毒害藻類分布及生態特征

續表2

注:“-”表示未檢出;“*”表示之前遼東灣沒有發現,但在中國其他海域有報道,“#”表示在中國海域沒有報道過;Hemolysin:溶血毒素,PSP-麻痹性貝毒,DSP-腹瀉性貝毒,NSP-神經性貝毒,YTX-蝦夷扇貝毒素; B:bloom-forming藻華, F:fish-killing噬魚,T:toxic有毒, Mixo:mixotrophy混合營養,Auto: autotrophy自養, Hetero: heterotrophic異養.

2.4 毒害藻類篩查

根據相關文獻篩查統計[5,21-24],此次檢測發現毒害藻類共29種,其中有9種藻類在中國海域未見報道,包括甲藻門5種、定鞭藻門2種、金藻門2種;另有9種藻類在遼東灣海域未見報道但在中國其他海域已報道,包括甲藻門8種、定鞭藻門1種.

產麻痹性貝毒(PSP)有8種,分別為相關亞歷山大藻、安氏亞歷山大藻、偽亞歷山大藻、李氏亞歷山大藻、假性亞歷山大藻伊姆裸甲藻、環節裸甲藻、微型裸甲藻.產腹瀉性貝毒(DSP)有2種,分別為漸尖鰭藻和微小原甲藻.產蝦夷扇貝毒素(YTX)有3種,分別為具刺膝溝藻多邊舌甲藻、網狀原角藻.產神經性貝毒(NSP)有2種,分別為短凱倫藻和日本纖囊藻.產溶血毒素(hemolysin)有13種,分別為紅色赤潮藻、多紋膝溝藻、微小卡羅藻、斯迪克里亞藻、里氏金色藻、魚腥棕囊藻、球形棕囊藻、約氏棕囊藻、波切棕囊藻、黃金色鞭毛藻、海洋卡盾藻、赤潮異彎藻.另外還有1種褐潮藻未知毒素,抑食金球藻,疑似含有胞外多糖(EPS).

檢測結果中很多OTUs只能注釋到屬水平,例如膝溝藻屬sp.,鰭藻屬sp.,棕囊藻屬sp.,卡爾藻屬sp.,定鞭金藻屬sp.,棕鞭藻屬sp.和硅鞭藻屬sp.等,由此可見,還有多種有毒藻類存在遼東灣海域,對水產品質量安全存在極大威脅.貝毒高發季節(春、夏)有毒有害藻類主要集中的區域(站位)見表2.

2.5 毒害藻類生態特征

根據篩查統計,曾引發赤潮或褐潮的種類有19種,可導致魚類大規模死亡的藻類有8種,主要為甲藻門.營養模式統計發現,有8種自養型、1種異養型、20種混合營養型藻類.

春、夏季為遼東灣毒害藻類生長高峰期,貝毒含量較高,直接威脅水產品質量安全.麻痹性貝毒(PSP)春季風險高發區主要集中在遼東灣東側瓦房店和旅順外海(10、12號站位)、夏季集中在遼東灣中西部覺華島海域(2號站位)、中東部瓦房店外海(10號站位)以及東南部大連旅順海域(12號站位);腹瀉性貝毒(DSP)主要集中在遼東灣的中西部海域(4、6號站位);神經性貝毒(NSP)主要集中在夏季遼東灣的南部海域(4、11號站位);蝦夷扇貝毒素(YTX)主要集中在夏季遼東灣的中西部覺華島海域、中東部瓦房店外海和東南部大連旅順海域(2、10、11、12號站位);溶血毒素(Hemolysin)在遼東灣海域分布范圍較廣(4、5、6、7、9、10、11、12號站位).從種類優勢度分析,凱倫藻屬sp.(NSP,遼東灣中北部海域5號站)、黃金色鞭毛藻(Hemolysin,中東部營口海域5、9號站位)、魚腥棕囊藻(Hemolysin,中部海域5、7號站位)、抑食金球藻(EPS,南部海域7、8號站位)對漁業生物風險隱患最大.

2.6 微藻毒素風險分布

麻痹性貝毒中毒后主要癥狀為舌頭、嘴唇發木、四肢無力等,低劑量(0.15mg)即可使人斃命.遼東灣分子鑒定產麻痹性貝毒的藻類有8種,總密度四季分布見圖2.

圖2 麻痹性貝毒產毒藻季節分布

麻痹性貝毒產毒藻在遼東灣分布較廣,四季所有站位均有檢出,密度相對較高.春季檢出密度分布在5.23~20.27×103ind/L之間,平均值為2.60× 103ind/L,最高值出現在10號站位,最低值出現在8號站位;夏季密度分布在0.17~8.28×103ind/L之間,平均值為2.02×103ind/L,最高值出現在2號站位,最低值出現在5號站位;秋季密度分布在9.19~44.69× 103ind/L之間,平均值為4.39×103ind/L,最高值出現在5號站位,最低值出現在12號站位;冬季密度分布在0.63~5.97×103ind/L之間,平均值為0.56×103ind/L,最高值出現在1號站位,2、4、9號站位均未超過400ind/L,其余站位均未超過50ind/L.

腹瀉性貝毒中毒的主要癥狀為嘔吐、腹瀉,嚴重者可出現黃疸、急性萎縮性肝壞死.遼東灣分子鑒定產腹瀉性貝毒(DSP)有2種,分別為漸尖鰭藻和微小原甲藻,秋、冬季未檢出,春、夏季總密度分布見圖3.

圖3 腹瀉性貝毒產毒藻季節分布

春季檢出毒藻密度分布在0~1708.57ind/L之間,平均值為228.07ind/L,最高值出現在綏中近岸的4號站位,6、8號站位未檢出,2、9、10號站位均超過100ind/L,其他站位均未超過60ind/L,遼東灣中部海域密度相對較低;夏季密度分布在0.01~655.08ind/L之間,平均值為144.03ind/L,最高值出現在西南側的4號站位,其次為12號站位(578.11ind/L),最低值出現在5號站位,1、6號站位均超過100ind/L,其他站位均未超過50ind/L,遼東灣中東部海域密度相對較低.

蝦夷扇貝毒素是一類含有2個磺?；闹苄远喹h聚醚類化合物,會造成肝臟損傷、壞死.遼東灣分子鑒定產蝦夷扇貝毒素的藻類有3種,總密度四季分布見圖4.

蝦夷扇貝毒素產毒藻在遼東灣分布較廣,四季都有分布.春季檢出密度分布在0~5436.36ind/L之間,平均值為1119.69ind/L,最高值出現在12號站位,6號站位未檢出,高值區主要分布在遼東灣的東南側大連近岸(10、11、12號站位密度均超過103ind/L),遼東灣中、西部海域密度相對較低;夏季密度分布在0.05~10589.88ind/L之間,平均值為2216.33ind/L,最高值出現在1號站位,最低值出現在5號站位,3、4、6、8、11號站位密度均超過200ind/L,高值區主要分布在遼東灣的西側近岸和東南海域(1、2、12號站位密度均超過103ind/L),遼東灣中部和東北部海域密度相對較低;秋季密度分布在0.59~7797.54ind/L之間,平均值為862.07ind/L,最高值出現在5號站位,最低值出現在7號站位,4、9號站位密度均超過300ind/L,高值區主要分布在遼東灣的西側近岸和東北部海域(2、5站位密度均超過103ind/L),遼東灣東南部海域密度相對較低;冬季密度分布在0.30~1289.12ind/L之間,平均值為127.47ind/L,最高值出現在遼東灣西北部的1號站位,其余站位均未超過70ind/L.

神經性貝毒是一類大環多醚類且極其耐熱的神經毒素,可以引起魚類大量死亡,當人吸入含有其毒素的氣霧時也會引起咳嗽、呼吸困難等中毒癥狀.遼東灣分子鑒定產神經性貝毒的藻類有2種,總密度四季分布見圖5.

神經性貝毒產毒藻在遼東灣分布較廣,四季都有分布,秋季密度相對較高.春季檢出密度分布在0~543.64ind/L之間,平均值為83.13ind/L,最高值出現在12號站位,2、6、8、9號站位未檢出,高值區主要分布在遼東灣的東南側大連近岸(10、11、12號站位密度均超過100ind/L),遼東灣中、西部海域密度相對較低;夏季密度分布在0~1058.99ind/L之間,平均值為148.21ind/L,最高值出現在1號站位,9號站位未檢出,高值區主要分布在遼東灣的西側近岸和東南海域(1、4、12號站位密度均超過200ind/L),遼東灣中部和東北部海域密度相對較低;秋季密度異常升高,分布在(0.47~1029.33)×103ind/L之間,平均值為95.54×103ind/L,最高值出現在5號站位,最低值出現在10號站位,高值區主要分布在遼東灣的東、西兩側海域(2、4、5、6、7、9、12號站位密度均超過103ind/L,其中2、4、9號站位密度均超過104ind/L,5號站位密度竟達到106ind/L),相對其他季節,秋季全海域密度普遍偏高;冬季密度回歸正常,分布在0.01~125.77ind/L之間,平均值為13.47ind/L,最高值出現在遼東灣西北部的1號站位,其余站位均未超過20ind/L.

圖4 蝦夷扇貝毒素產毒藻季節分布

溶血毒素最早發現是由病原微生物所產生的,能導致機體紅細胞及其他有核細胞裂解的毒素類物質.近些年發現,某些海洋微藻可引起魚類大量死亡,可產生使動物血紅細胞溶解破裂的溶血毒素.遼東灣分子鑒定產溶血毒素的藻類有12種,總密度四季分布見圖6.

溶血毒素產毒藻在遼東灣分布較廣,四季都有分布,密度相對較高.春季檢出密度分布在6.46~ 18.33×103ind/L之間,平均值為2.81×103ind/L,最高值出現在10號站位,8號站位最低,高值區主要分布在遼東灣的東南側大連近岸(2、5、9、10、11、12號站位密度均超過103ind/L),遼東灣中、西部海域密度相對較低;夏季密度分布在13.94~18.70× 103ind/L之間,平均值為6.55×103ind/L,最高值出現在6號站位,5號站位最低,高值區主要分布在遼東灣的西側近岸和東南海域(除了5、9號站位,其余站位密度均超過×103ind/L,其中1、6、12號站位密度均超過104ind/L),遼東灣東北部海域密度相對較低;秋季密度分布在41.37~36.22×103ind/L之間,平均值為3.80×103ind/L,最高值出現在5號站位,最低值出現在10號站位,高值區主要分布在遼東灣的東、西兩側海域(2、4、5、9、12號站位密度均超過103ind/L,其中5號站位密度均超過104ind/L),遼東灣中南部海域密度相對較低;冬季密度分布在1.05~19.74×103ind/L之間,平均值為2.59×103ind/L,最高值出現在9號站位,最低值出現在10號站位,高值區主要分布在遼東灣的東、西兩側海域(1、9、12號站位密度均超過103ind/L,其中9號站位密度均超過104ind/L),遼東灣中部密度相對較低.

圖5 神經性貝毒產毒藻季節分布

圖6 溶血毒素產毒藻季節分布

2.7 毒害藻類環境關聯

遼東灣各季節產毒藻類總密度與環境因子的相關系數見表3.分析發現,春季SST對YTX、NSP產毒藻影響顯著負相關,夏季COD、Oil、DIN、Pb、Cd對各產毒藻類密度影響顯著正相關,秋季各環境因子對各產毒藻類影響不顯著,冬季Zn、As、Oil、DIN對各產毒藻類影響顯著正相關,SST對各產毒藻類影響顯著負相關.

表3 遼東灣產毒藻類密度與環境因子相關系數

注:“*”表示顯著相關(P<0.05); “**”表示極顯著相關(<0.01).

3 討論

3.1 分子鑒定獲得的藻類疑似新記錄種

基因測序技術的快速發展突破了小粒徑藻類傳統形態學鑒定局限,提高了調查靈敏度、準確度和檢測效率.遼東灣海域毒害藻類占所有注釋種類22%,其中甲藻門占毒害藻類67%、定鞭藻門占20%、金藻門占10%、黃藻門占3%.注釋到種的29種毒害藻類中,有18種在遼東灣海域未見報道,其中有9種在中國海域未見報道,甲藻門居多.例如本次檢測出的新種斯迪克里亞藻,有侵噬魚類細胞殺魚的能力,曾于2004年在韓國慶南馬山海域引起魚類成群死亡.該藻之前在中國海域未見報道,本研究發現其在遼東灣主要分布在東西兩岸,致災風險較高,其危害后果嚴峻,本次檢出的8種可導致魚類大規模死亡的藻類應引起有關方面足夠重視[25-26].

不可否認,新發現的藻類也可能是土著種,由于調查的偶然性和鑒定技術限制暫未被發現.例如,2008年中國海域發現了全溝藻屬(sp.),并定種為尖尾全溝藻()[27],2012年,鑒定為纖細全溝藻(),并認為是首次發現.除此之外,瑪氏骨條藻()之前被定為中肋骨條藻(),后來經鑒定[28],將其改為瑪氏骨條藻.

本次檢測獲得的藻類DNA信息大部分未能注釋到種,主要原因可能是由于某些種類很難培養,基因序列無法獲得,造成18s rDNA數據庫浮游植物種類不全,注釋到種的成功率較低所致.關于分子鑒定的準確性尚有部分學者存有疑慮,主要影響因素有擴增區域的選擇、引物的選擇或組合、PCR的偏好性、擴增效率的差異、讀長的清晰度或解析度和數據庫的完善度等[29].但相比傳統形態學鏡檢方式,對物種多樣性的發掘已經提升了一個數量級,尤其對微型、微微型浮游植物的發現提供了科學手段,同時大大降低了形態學鑒定的人為主觀誤差.

3.2 毒害藻類生態特征及潛在風險

本次研究發現的毒害藻類除混合營養型、自養型、異養型等營養模式外,也出現了較多共生生態模式藻類,寄生性共甲藻目的OTU數目占總數20%,因數據庫收錄信息較少,絕大多數沒有獲得種水平的注釋信息,光合共生甲藻五刺多甲藻在本次調查中也檢測出其與硅藻共生.甲藻具有多種營養模式,包括自養型、異養型、混合營養型,能夠在低光照條件下利用微小的溶解有機物滿足其生長和繁殖,相對于光合自養型,混合營養型的浮游植物生態競爭力更強[30-31].

遼東灣麻痹性貝毒產毒藻夏季占比最高(42.50%),春、秋季次之(分別為27.67%、21.94%),冬季最低(8.88%),可見夏季為麻痹性貝毒高發季節,春、秋季也不容忽視,大連、營口、錦州、葫蘆島近岸都是麻痹性貝毒潛在高風險區;蝦夷扇貝毒素產毒藻也是夏季占比最高(50.30%),春、秋季次之(分別為23.22%、19.14%),冬季最低(7.35%),與麻痹性貝毒分布規律一致,大連渤海近岸和葫蘆島近岸是蝦夷扇貝毒素高風險區;腹瀉性貝毒產毒藻只在春、夏季有檢出,主要由漸尖鰭藻和微小原甲藻貢獻,遼東灣東西兩岸是腹瀉性貝毒高風險區;神經性貝毒產毒藻秋季占絕對優勢(88.54%),春、夏、冬分別為4.79%、6.04%、0.63%,秋季產毒藻密度主要由短凱倫藻貢獻,可見秋季為神經性貝毒高發季節,遼東灣全海域都是高風險區;溶血毒素產毒藻夏季優勢明顯(56.44%),春、夏、冬組成相似,分別為17.36%、14.36%、11.83%,夏季產毒藻密度主要由魚腥棕囊藻、紅色赤潮藻、黃金色鞭毛藻、斯迪克里亞藻貢獻,可見夏季為溶血毒素高發季節,遼東灣全海域都是高風險區.

3.3 毒害藻類生長的環境控制因子

由于調查站位數量所限,產毒藻類在各站位間差異較大,加之研究區域各環境因子差異不明顯,本次統計分析的各產毒藻類密度與環境因子的相關性不高,也可能與產毒藻類生長密切相關的環境因子未獲分析導致.

遼東灣產毒藻類的生長繁殖受水體中理化環境因子的綜合影響,春季只有水溫對YTX、NSP產毒藻影響負顯著相關;夏季有機(COD、Oil)與無機(DIN)環境及部分重金屬(Pb、Cd)對各產毒藻類影響顯著正相關;秋季各環境因子對各產毒藻類生長繁殖影響較小;冬季部分重金屬(Zn、As)對各產毒藻類影響均很顯著,金屬元素之間的協同作用顯著地促進了產毒藻類的生長[32],Oil、DIN也刺激了溶血毒素產毒藻類的生長[33-34],而低水溫限制了各產毒藻類的生長繁殖.由于遼東灣海域水體理化環境的多變性和年際差異性,往往會造成環境因子對產毒藻類群落結構影響的差異性變化[35].

4 結論

4.1 本次研究發現遼東灣毒害藻類共29種,曾引發赤潮或褐潮的種類有19種,可導致魚類大規模死亡的有8種,主要為甲藻門.有18種疑似為遼東灣新記錄種,其中9種在中國海域未見報道;發現麻痹性貝毒(PSP)產毒藻8種,腹瀉性貝毒(DSP)產毒藻2種,產蝦夷扇貝毒素(YTX)產毒藻3種,神經性貝毒(NSP)產毒藻2種,溶血毒素(hemolysin)產毒藻13種,另外還有1種褐潮產毒藻(EPS).

4.2 遼東灣檢出的毒害藻類中有8種自養型、1種異養型、20種混合營養型藻類.麻痹性貝毒、蝦夷扇貝毒素、溶血毒素在夏季風險較高,神經性貝毒在秋季風險較高,腹瀉性貝毒在春、夏季風險均較高,遼東灣東西兩岸是貝毒風險高發區.

4.3 遼東灣春季SST對YTX、NSP產毒藻影響顯著負相關;夏季COD、Oil、DIN、Pb、Cd對各產毒藻類影響顯著正相關;秋季各環境因子對各產毒藻類影響不顯著;冬季Zn、As、Oil、DIN對各產毒藻類影響顯著正相關,SST對各產毒藻類影響顯著負相關,各產毒藻類與環境因子關聯性有待于進一步發掘.

[1] 劉永健,劉 娜,劉仁沿,等.赤潮毒素研究進展 [J]. 海洋環境科學, 2008,27(增刊2):151-159.

[2] Pearse M C, H?kan E, Philipp H. Freeze-drying for the stabilisation of shellfish toxinsin mussel tissue () reference materials [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007,387:2475–2486.

[3] Suzuki T, Quilliam M A. LC-MS/MS analysis of diarrhetic shellfish poisoning (DSP) toxins, okadaic acid and dinophysistoxin analogues, and other lipophilic toxins [J]. Analytical Sciences, 2011,27(6):571- 584.

[4] Armi Z, Turki S, Trabelsi E, et al. Occurrence of diarrhetic shellfish poisoning (DSP) toxins in clams () from Tunis north lagoon [J]. Environ Monit Assess, 2012,184(8):5085-5095.

[5] 宋 倫,宋廣軍,王年斌,等.黃渤海產毒藻類及貝毒研究現狀[J]. 水產科學, 2013,32(7):430-436.

[6] 宋 倫,劉衛東,吳 景,等.有害甲藻在遼東灣的時空分布[J]. 生態學報, 2017,37(4):1339-1345.

[7] 田 華. 麻痹性貝毒的累積、轉化、排出過程及預警診斷指標研究 [D]. 青島:中國海洋大學, 2009:1-93.

[8] 劉衛東,宋 倫,吳 景.環境樣本中微型和微微型浮游植物高通量測序的引物優化[J].生態學報, 2017,37(12):4208-4216.

[9] Amaral Z L, Artigas L F, Baross J, et al. A global census of marine microbes.life in the world′s oceans: diversity,distribution and abundance [M]. Oxford:Blackwell Publishing Ltd., 2010:223-245.

[10] 于 杰.浮游生物多樣性高效檢測技術的建立及其在渤海褐潮研究中的應用 [D]. 青島:中國海洋大學, 2014.

[11] 宋 倫,吳 景,宋永剛,等.褐潮致災種抑食金球藻在遼東灣的分布 [J]. 環境科學研究, 2017,30(4):537-544.

[12] 宋 倫,畢相東.渤海海洋生態災害及應急處置 [M]. 沈陽:遼寧科學技術出版社, 2015:175-210.

[13] Song Lun, Yang Guojun, Wang Nianbin, et al. Relationship between environmental factors and plankton in the Bayuquan Port, Liaodong Bay, China: a five-year study [J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology. 2016,34(4):654-671.

[14] DB21/T 2254-2014 海洋貝毒預警監測技術規程 [S].

[15] Dong Shaojie, Bi Xiangdong, N.WANG, Song Lun, et al. Algicidal activities of Cladophora fracta on red tide-forming microalgae Heterosigma akashiwo and Gymnodinium breve. Allelopathy Journal, 2016,37(2):231-240.

[16] GB/T 12763-2007 海洋調查規范 [S].

[17] GB17378-2007 海洋監測規范 [S].

[18] 宋 倫,吳 景,劉衛東,等.渤海長興島海域微型和微微型浮游植物多樣性 [J]. 環境科學研究, 2016,29(11):1635-1642.

[19] Quast C, Pruesse E, Yilmaz P,et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research, 2013,41:590-596.

[20] Rao Fu, Jun Gong.Single cell analysis linking ribosomal (r)DNA and rRNA copy numbers to cell size and growth rate provides insights into molecular protistan ecology [J]. Journal of Eukaryotic Microbiology 2017,64:885–896.

[21] 劉瑞玉.中國海洋生物名錄 [M]. 北京:科學出版社, 2008:301-870.

[22] 趙冬至.中國典型海域赤潮災害發生規律 [M]. 北京:海洋出版社, 2010:1-389.

[23] 宋 倫,宋廣軍.遼東灣浮游植物生態特征研究 [M]. 沈陽:遼寧科學技術出版社, 2016:437-440.

[24] Xu Xin, Yu Zhiming, Cheng Fangjin, et al. Molecular diversity and ecological characteristics of the eukaryotic phytoplankton community in the coastal waters of the Bohai sea, China [J].Harmful Algae,2017, 61:13-22.

[25] Jeong H J, Kim J S, Park J Y, et al.n. gen., n. sp. (Dinophyceae) from the Coastal Waters off Southern Korea: Morphology and Small Subunit Ribosomal DNA Gene Sequence [J]. The Journal of Eukaryotic Microbiology, 2005,52(4):382-390.

[26] Jeong H J, Kim J S, Kim J H, et al. Feeding and grazing impact of the newly described heterotrophic dinoflagellateon the harmful alga[J]. Marine Ecology Progress Series, 2005,295:69-78.

[27] Xing Xiaoli, Lin Xuyin, Chen Changping,et al.Observations of several cryptomonad flagellates from China Sea by scanning electron microscopy[J]. Journal of Systematics Evolution, 2008,46(2):205- 212.

[28] Sarno D, Wiebe H C F K, Linda K M, et al. Diversity in the genus Skeletonema (Bacillariophyceae). II. An assesment of the taxonomy of S. costatum-like species with the description of four new species[J]. Journal of Phycology, 2005,41(1):151-176.

[29] 王雪芹,王光華,喬 飛,等.高通量測序及其在食物網解析中的應用進展 [J]. 生態學報, 2017,37(8):2530-2539.

[30] 宋 倫,宋廣軍,王年斌,等.遼東灣網采浮游植物粒級結構的脅迫響應[J]. 中國環境科學, 2015,35(9):2764-2771.

[31] 宋 倫,宋廣軍,王年斌,等.遼東灣浮游生物粒徑結構穩定性分析[J]. 中國環境科學, 2015,35(10):3117-3126.

[32] Bruland K W, Orians K J, Cowen J P. Reactive trace metals in the stratified central North Pacific [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 1994,58(15):3171-3182.

[33] 張玉鳳,田 金,楊 爽,等.大連灣海域營養鹽時空分布、結構特征及其生態響應 [J]. 中國環境科學, 2015,1:236-243.

[34] 李清雪,陶建華.應用浮游植物群落結構指數評價海域富營養化 [J]. 中國環境科學, 1999,19(6):548-551.

[35] 鄧春梅,于志剛.東海、南黃海浮游植物粒級結構及環境影響因素分析 [J].中國海洋大學學報, 2008,38(5):791-798.

An evaluation of the risks from toxic algae and their relationships with environmental conditions in Liaodong Bay.

SONG Lun1,2, WU Jing2, LI Nan2, DU Jing2, WANG Kun2, LIU Gui-ying2, WANG Peng1*

(1.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, School of Environment, Harbin Institute of Technology, Haerbin 150090, China；2.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China)., 2018,38(8)：3049~3059

Taking the V4region of 18S rDNA as the target gene, we designed the primer V4 (F/R) and adopted high-throughput sequencing technology to evaluate the diversity and relative abundance of the eukaryotic phytoplankton community in different seasons of the year 2014 in Liaodong Bay. The results showed that there were 29 toxic algae in Liaodong Bay, including 8kinds of paralytic shellfish poisoning (PSP) algae, 2kinds of diarrhetic shellfish poisoning (DSP) algae, 3kinds of yessotoxic (YTX) algae, 2kinds of neurotoxic shellfish poisoning (NSP) algae, 13kinds of hemolysin, and a kind of exopolysaccharide (EPS) algae. Of these, 19toxic algae were reported to have caused either red or brown tides. Eight of the toxic algae, most of which belonged to Dinophyta, were capable of causing large-scale fish deaths. We found 18algal species that had been previously undetected or unreported in Liaodong Bay, in which 9algal species even had not previously appeared in other Chinese waters. The algal species had different trophic modes, including 8kinds of autotrophs, 20kinds of mixotrophs, and a kind of heterotroph. There were high risks from PSP, YTX, and NSP in summer;high risks from NSP in autumn; high risks from DSP in spring and summer; and the eastern and western waters of Liaodong Bay were prone to shellfish toxicity disasters. During spring, the water temperature was significantly and negatively correlated with the biomass of YTX and NSP algae. During summer, some environmental factors, such as chemical oxygen demand, oil, dissolved inorganic nitrogen (DIN), lead, and cadmium, were significantly and positively correlated with toxin-producing algae, but zinc, arsenic, oil, and DIN were positively correlated with toxic algae in the winter. The environmental factors were not significantly correlated with toxic algae in the autumn. The correlations between toxic algae and environmental factors should be further explored.

toxic algae；shellfish poisoning；risk distribution；environmental correlation；Liaodong Bay

X171.1

A

1000-6923(2018)08-3049-11

宋 倫(1980-),男,遼寧大連人,副研究員,碩士,主要從事海洋生物生態學研究.發表論文60余篇.

2018-01-10

國家自然科學基金資助項目(51779066);遼寧省海洋與漁業科研項目(201710);大連市高層次人才創新支持計劃-青年科技之星項目(2016RQ080)

* 責任作者, 教授, pwang73@vip.sina.com