散偏湯對偏頭痛模型大鼠中腦、三叉神經節CGRP、PENK基因、蛋白表達的影響*

劉 燕 趙永烈 劉金民△

（1.北京市第一中西醫結合醫院，北京 100026；2.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100000）

偏頭痛是一種發病率很高的原發性頭痛，目前我國的患病率為9.3%［1］，嚴重危害國人健康。近年研究發現，偏頭痛涉及三叉神經血管系統［2-4］。傷害性感受刺激三叉神經的初級神經元，經三叉神經脊束核傳入顱內疼痛中樞 （丘腦、導水管周圍灰質尾側腹外側區域），再傳到皮質（島回額葉皮質、前扣帶回）產生頭痛。在偏頭痛發生過程中，三叉神經節是偏頭痛發生的關鍵結構，中腦導水管周圍灰質在疼痛信息傳遞和調制中起關鍵作用，環繞血管周圍的三叉神經末梢含有的血管活性肽類物質（P物質SP、降鈣素基因相關肽CGRP、神經激肽NK、內源性阿片肽等）可能是偏頭痛發生的關鍵病理生理環節。課題組前期復制了偏頭痛動物模型，對川芎等中藥對偏頭痛模型的鎮靜鎮痛作用進行了初步研究，現為了進一步探索中藥方劑散偏湯治療偏頭痛的生物學作用機制，進行以下研究?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SPF級SD大鼠24只，體質量（200±20）g，由維通利華公司實驗動物中心提供。合格證號：SCXK（京）2016-0006。實驗動物飼養普通級實驗動物房，相對溫度波動在（22±2）℃，相對濕度在30%～40%，喂養常規飼料，自由進食飲水。

1.2 試藥與儀器

1）試藥。散偏湯顆粒劑（組成：川芎 30 g，白芍15 g，白芷 10 g，白芥子 10 g，柴胡 10 g，制香附 10 g，郁李仁6 g，生甘草3 g。購自北京市第一中西醫結合醫院，江陰天江藥業有限公司，檢驗批號：白芍1707031、香附 1706138、川芎 1701019、郁李仁 1611050、柴胡1705123、白芥子 1609007、甘草 1706018、白芷 1611077）；硝酸甘油注射液（5 mg/mL，北京益民藥業有限公司生產，生產批號：H11020289。琥珀酸舒馬普坦，天津華津制藥有限公司，國藥準字H20040700）；TRNzol總RNA提取試劑［天根生化科技（北京）有限公司DP405-02］；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa（寶生物）RR047B）；SYBRTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）， ROX plus［TaKaRa（寶生物）RR82LR］；DL2，000 DNA Marker（TaKaRa（寶生物）3427Q）引物合成（Invitrogen）；CGRP 兔多抗（Abcam ab47027）；βactin 鼠單抗（Immunoway YM3028）。 2）儀器。 Thermo Fresco21低溫冷凍離心機（美國賽默飛世爾Thermo公司）；Thermo MultiSkan3酶標儀 （美國賽默飛世爾Thermo公司）；Cavoy Mini P-4電泳槽 （北京凱元信瑞儀器有限公司）；Cavoy濕轉電泳槽 （北京凱元信瑞儀器有限公司）；Bio-Rad電泳儀 （美國伯樂Bio-Rad公司）；其林貝爾水平脫色搖床 （其林貝爾脫色搖床公司）；Hanna酸度計 pH211（意大利哈納HANNA公司）；Fluka電動組織勻漿器 （美國 Fluka公司）；FlukaQL-902渦旋振蕩儀 （美國 Fluka公司）；Centrifuge 5415D離心機 （德國 Eppendorf公司）；NANODROP 2000分光光度計（美國賽默飛世爾Thermo公司）；凝膠成像系統Tanon 1600（山東灝洋實驗儀器設備有限公司）；ABI7500熒光定量PCR儀（美國賽默飛世爾Thermo公司）。

1.3 動物分組

24只大鼠隨機分為生理鹽水組、偏頭痛模型組、琥珀酸舒馬普坦組、散偏湯組，每組6只。

1.4 模型制備及干預方法

動物適應性喂養1周后進行造模及干預。1）生理鹽水組：大鼠頸背部皮下注射2 mL/kg 0.9%氯化鈉注射液，每周1次，連續3周，于第2次注射0.9%氯化鈉注射液后給予10 mL/（kg·d）0.9%氯化鈉注射液灌胃，普通飼養。2）偏頭痛模型組：大鼠頸背部皮下注射硝酸甘油 10 mg/kg（5 mg/mL）造模，每周 1次，連續 3周，于第2次注射硝酸甘油后給予10 L/（kg·d）0.9%氯化鈉注射液灌胃，共1周，普通飼養。3）琥珀酸舒馬普坦組：大鼠頸背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg（5 mg/mL）造模，每周1次，連續3周，于第2次注射硝酸甘油后給予琥珀酸舒馬普坦 6 mg/（kg·d）灌胃，共 1 周，普通飼養。4）散偏湯組：大鼠頸背部皮下注射硝酸甘油溶液10 mg/kg（5 mg/mL）造模，每周 1 次，連續 3周，于第 2次注射硝酸甘油后給予散偏湯顆粒劑9.1 g/（kg·d）（分別按成人每天生藥量91 g算，大鼠用藥量按成人藥量6倍算，大鼠每日灌胃體積為10 mL/kg，藥液濃度為0.91 g/mL），散偏湯顆粒劑灌胃，共1周，普通飼養。最后1次硝酸甘油造模2 h后，給予2%戊巴比妥鈉液腹腔注射麻醉（麻醉劑量：40 mg/kg），提取標本，斷頭取腦，在干冰保護下快速將大鼠中腦及三叉神經節剝離，放置-70℃冰箱中備用。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 一般情況觀察 觀察動物適應性喂養7 d內的一般情況（包括精神、活動、皮毛色澤、進食、大便等情況）。觀察第3次注射硝酸甘油或0.9%氯化鈉注射液后的行為變化，記錄大鼠搔頭次數：以前肢搔臉1次計1次，后肢快速搔頭動作從開始到停止計1次，皮下注射硝酸甘油后至2 h的搔頭次數，以判斷實驗模型復制是否成功［5］。

1.5.2 Western blotting法測定三叉神經節CGRP蛋白表達變化 準備進行SDS-PAGE，5%濃縮膠，12%分離膠，取經樣品緩沖液變性處理后的待檢測組織蛋白樣品上樣，每孔20 μg。濕轉法轉膜完成后經麗春紅染色試劑對膜進行染色并鑒定轉膜效果。將轉膜良好的膜完全浸沒于5%BSA-TBST中，室溫輕搖封閉30 min，用5%BSA-TBST稀釋一抗，稀釋比例CGRP兔多抗1∶1000，室溫振搖 10 min，充分混勻抗體，放 4℃搖床振搖過夜。第2日TBST洗膜5次，每次5 min，用5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG（H+L）HRP，1∶10000，室溫輕搖 40 min，TBST 洗膜 6 次，每次 5 min，ECL孵育，X光膠片曝光經顯影，定影后，掃描ImageJ軟件處理圖片，TotalLab Quant讀取條帶IOD值。

1.5.3 Real time PCR檢測大鼠中腦CGRP基因表達變化 采用TRNzol法提取組織樣品總RNA，使用NanoDropTMND-2000測定RNA濃度和純度。逆轉錄合成cDNA采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA反轉錄后，將96-PCR板置于Real time PCR儀上進行PCR擴增反應，CGRP上游引物CCTAGACCTGGGCACCCT，CGRP下游引物CTTCT GGGAAATGACACTGGA。按以下程序進行：95 ℃，30 s；40 個 PCR 循環［95℃，5 s；60℃，40 s（收集熒光）］。為了建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束后，按（95 ℃，10 s；60℃，60 s；95 ℃，15 s）；并從 60 ℃緩慢加熱到99℃（儀器自動進行-Ramp Rate為0.05 ℃/s）。

1.6 統計學處理

應用SPSS22.0統計軟件，首先進行正態分布和方差齊性檢驗，符合正態分布和方差齊性的數據，以（±s）表示，各組間進行單因素方差分析，并行LDS檢驗；不符合正態分布和方差不齊性，采用非參數檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況觀察

見表1。適應性喂養期間各組大鼠一般情況良好，精神、毛發、食欲及大便正常。第3次注射硝酸甘油后大鼠行為學變化明顯，模型組與生理鹽水組搔頭次數差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠2 h內行為學變化比較（次，±s）

表1 各組大鼠2 h內行為學變化比較（次，±s）

與偏頭痛模型組比較，*P＜0.05。下同

組 別 n 搔頭次數偏頭痛模型組 6生理鹽水組 6琥珀酸舒馬普坦組 6 75.00±5.55 15.17±1.17*52.33±5.32*散偏湯組 657.17±1.94*

2.2 各組大鼠三叉神經節中CGRP、PENK蛋白表達比較

見表2，圖1。偏頭痛模型組三叉神經節CGRP蛋白表達較生理鹽水組顯著升高（P＜0.05）；散偏湯和琥珀酸舒馬普坦干預后，CGRP含量降低，與偏頭痛模型組差異有統計學意義（P＜0.05）；散偏湯和琥珀酸舒馬普坦組干預后CGRP蛋白表達與生理鹽水組差異無統計學意義（P＞0.05）。偏頭痛模型組三叉神經節PENK蛋白表達較生理鹽水組降低（P＜0.05），散偏湯組和琥珀酸舒馬普坦組干預后PENK蛋白表達升高，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組三叉神經節中 CGRP、PENK表達比較（±s）

表2 各組三叉神經節中 CGRP、PENK表達比較（±s）

組 別 n CGRP PENK偏頭痛模型組 6生理鹽水組 6琥珀酸舒馬普坦組 6 69397.00±16227.65 59133.50±19548.17 20334.00±26475.41*76597.17±15117.16*40124.60±24243.19*76507.67±10413.65*散偏湯組 640144.67±22944.31*76402.00±4921.75*

圖1 各組大鼠三叉神經節中CGRP、PENK蛋白表達

2.3 各組大鼠中腦CGRP、PENK基因表達比較 見表3。偏頭痛模型組大鼠中腦CGRP基因表達較生理鹽水組升高（P＜0.05）；散偏湯和琥珀酸舒馬普坦干預后，CGRP基因表達減少，與偏頭痛模型組差異有統計學意義（P＜0.05），與生理鹽水組差異無統計學意義（P＞0.05），散偏湯與琥珀酸舒馬普坦組差異無統計學意義（P＞0.05）；偏頭痛模型組中腦PENK蛋白表達較生理鹽水組降低，差異無統計學意義（P＞0.05），散偏湯組和琥珀酸舒馬普坦組中腦PENK基因表達與模型組比較升高，差異無統計學意義（P＞0.05），與生理鹽水組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠中腦CGRP、PENK表達比較（±s）

表3 各組大鼠中腦CGRP、PENK表達比較（±s）

組 別 n CGRP PENK偏頭痛模型組 6生理鹽水組 6琥珀酸舒馬普坦組 6 2.80±2.38 0.77±0.19 0.93±0.29* 0.83±0.17 0.66±1.98* 0.87±0.21散偏湯組 60.66±0.21* 0.91±0.19

3 討 論

散偏湯記載于清·陳士鐸《辨證錄·卷二》，主治半邊頭風。陳士鐸認為“此病得之郁氣不宣，又加風邪襲之于少陽之經”。故應用散偏湯祛風疏肝，通絡止痛，方藥白芍、川芎、郁李仁、柴胡、白芥子、香附、甘草、白芷組成。散偏湯中川芎為君藥，辛香善升，祛風止痛作用，為治頭痛要藥；白芷祛風解表，燥濕通竅，消痰，助川芎散頭風；白芥子通竅蠲痰，引藥入深，直達病所；柴胡、香附升清舉陽、疏肝達郁?，F代醫家常用散偏湯治療偏頭痛，其臨床療效顯著［6］，但其作用機制尚不完全明確。

CGRP是一種神經肽，廣泛存在于中樞和周圍神經系統的感覺神經元胞體和末梢，通過外周炎癥和中樞調節來提高偏頭痛患者的神經傳遞［7-8］。CGRP在外周由背根神經節合成，在中樞由三叉神經節合成，偏頭痛發作時，血管周圍神經末梢和三叉神經節釋放CGRP到頸內外靜脈，外周血中CGRP濃度升高，CGRP作用于血管平滑肌引起血管擴張，外周血管擴張引起硬腦膜肥大細胞脫顆粒，釋放許多神經活性及血管活性物質，如TNF-α、5-HT、組胺、緩激肽等引起神經源性炎癥，這些致炎因子又可刺激CGRP的持續釋放。CGRP同時通過軸突反射將外周組織的局部感覺傳到中樞，CGRP在偏頭痛的發病過程除了發揮疼痛遞質外還通過AMPA（AMPA）型谷氨酸受體導致疼痛致敏，放大痛覺信號?？傊?，在偏頭痛的發病過程中，CGRP在多個階段發揮廣泛且重要的作用，是偏頭痛發生的分子生物學特征之一，為CGRP受體拮抗劑治療偏頭痛的理論基礎［8］。也是偏頭痛研究領域不可忽視的重要理論之一。

內啡肽（EOPS）是在體內發揮嗎啡樣效應的神經肽，是神經肽中與疼痛關系比較密切的一類物質，在腦內和脊髓中有明顯的鎮痛作用，腦啡肽（ENK）是內啡肽的一種，PENK是ENK系統的前體（包括甲硫氨酸-腦啡肽、亮氨酸-腦啡肽、甲七肽和甲八肽等）。內啡肽系統在外周主要是通過抑制神經元興奮，延緩痛覺信號的擴散和傳遞，發揮鎮痛作用；在中樞主要是影響中腦導水管周圍灰質、延髓腹內側核等內源性痛覺調制系統內的脊髓投射神經元的活化，激活痛覺下行抑制系統，發揮鎮痛作用，研究內啡肽系統在腦內的鎮痛作用在偏頭痛治療的研究中有著重要意義。

我國文獻在殷商甲骨文就有“疾首”的交記載，《內經》稱本病為“腦風”“首風”。中醫學認為腦為清陽之府，易受風邪，風邪上擾，津液氣血運行失常，津聚成痰，氣血瘀滯，痰瘀阻竅，腦失清靈不通則痛。散偏湯作為中藥治療偏頭痛，組方治法治則對偏頭痛發病的病因病機有針對性，且無藥物依賴、成癮及藥物過量性頭痛出現的危險，同時現代藥理學研究發現散偏湯中的川芎、白芷、白芍、白芥子、香附均有不同程度的鎮靜鎮痛作用［10-15］。在本實驗研究中觀察到散偏湯組大鼠在注射硝酸甘油后煩躁、搔頭的表現較偏頭痛模型組明顯減少，以安靜蜷臥為主，其后間斷活動，說明散偏湯能夠改善偏頭痛動物模型的行為學癥狀，有一定的鎮靜鎮痛作用。研究中觀察到中腦及三叉神經節CGRP基因及蛋白表達下降，三叉神經節中PENK蛋白表達升高，并且有統計學意義，實驗大鼠中腦中PENK表達下降，但經散偏湯和琥珀酸舒馬普坦干預后較偏頭痛模型組有所升高，考慮散偏湯能夠減少CGRP在中腦和三叉神經節的表達，提高鎮痛物質PENK在中腦和三叉神經節的表達。本實驗中散偏湯和舒馬普坦能夠改善硝酸甘油造成偏頭痛大鼠的病理狀態，能夠抑制CGRP介導疼痛信號的傳導，改善內啡肽系統中樞鎮痛作用，對散偏湯治療偏頭痛提供了客觀的物質基礎，可能為散偏湯鎮靜鎮痛的機制之一。課題組將進一步研究散偏湯在偏頭痛作用的靶點和機制，為臨床治療提供依據。