小麥不同器官表皮蠟質的組分及晶體結構分析

趙 帥，羅文巧，王 聰，吳洪啟，汪 勇，王中華,權 力

(西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100)

植物表皮蠟質是覆蓋在植物表面與外界環境之間的一層疏水性保護屏障，主要由超長鏈脂肪酸及其衍生物如脂肪酸、烷烴、初級醇、醛、二酮和酯等化合物組成[1]，可以起到防止水分的非氣孔性散失，進而增強植物抵御干旱的能力[2]。除此之外，表皮蠟質在植物抵抗病菌入侵、昆蟲吞食[3]以及紫外輻射、霜凍傷害[4-5]等生物和非生物脅迫中也表現出重要的作用。表皮蠟質的晶體結構會因物種的不同或同種植物的器官不同，而表現出不同的類型，蠟質晶體的結構主要有柱狀、片狀、管狀、線狀等，并且蠟質晶體結構的差異主要由構成蠟質晶體的化學成分決定，片狀晶體主要含有初級醇等成分，而管狀晶體通常含有大量的 β-二酮[6]。同時，蠟質含量較高的植物表面往往呈白霜狀表型[7-8]。

小麥作為我國主要的糧食作物之一，其產量受到干旱、蟲害、病害等生物脅迫和環境脅迫的嚴重影響。近年來，大量關于植物表皮蠟質以及其植物生物學功能的研究表明，植物表皮蠟質對植物的生長發育有很大的影響[9-10]。在大麥的穎殼和葉片的表皮蠟質成分中，穎殼的烷烴和二酮含量占比相對于葉片明顯升高[11]。對小麥的研究也表明，烷烴和二酮在穎殼表皮蠟質組分中占有較大比例，而在葉片表皮蠟質組分中初級醇占有絕對優勢[12]。隨著小麥的生長發育，葉片的表皮蠟質成分中烷烴和二酮的比例大幅提高，并且隨著生長進程的推進而繼續增加，但初級醇仍占據主導地位[12]。這些研究盡管對小麥一些器官的表皮蠟質進行測定和分析，但僅選取了部分器官的表皮蠟質，缺乏整體性。目前，對小麥不同器官整體蠟質組分和含量的相關研究較少。本研究選取表皮蠟質表型存在明顯差異的兩個小麥品種泰山4447和濟麥6097，對其7個不同器官的表皮蠟質組分進行測定，利用掃描電鏡觀察蠟質晶體結構，通過比較小麥不同器官的表皮蠟質組分和晶體結構差異，并結合失水率檢測分析表皮蠟質對葉片中水分的非氣孔性散失產生的影響，以期為揭示小麥蠟質的合成機理以及蠟質成分與抗逆性的關系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料為表皮蠟質表型存在明顯差異的兩個小麥品種泰山4447(綠色表型)和濟麥6097(白霜狀表型)。試驗材料種植于西北農林科技大學西區科研試驗田，在小麥抽穗期采集穗部、葉鞘、穗下莖、旗葉、倒二葉、倒三葉和倒四葉七個器官的表皮蠟質進行氣相色譜分析、掃描電鏡觀察和生理指標檢測。

1.2 方 法

1.2.1 蠟質的提取

將一定樣品置于裝有25 mL三氯甲烷的50 mL玻璃燒杯中45 s，操作中輕輕搖晃燒杯加速蠟質溶解，而后加入20 μL C24烷烴作為內標并將燒杯放置于通風廚中室溫蒸發。待三氯甲烷揮發完全后，重新加入5 mL三氯甲烷溶解并用膠頭滴管轉入15 mL樣品瓶，而后置于通風廚中室溫靜置蒸發。待揮發完全后重新加入1 mL三氯甲烷并用漏斗過濾到GC樣品瓶中。三氯甲烷揮發完全后分別加入20 μL吡啶和20 μL雙(三甲基硅烷基)三氯乙酰胺[Bis-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide]，密封后放入70 ℃水浴鍋中衍生反應1 h。反應完全后用氮氣恒溫吹干儀(70 ℃)吹干GC樣品瓶后重新加入1 mL三氯甲烷溶解蠟質，最后使用氣相色譜-質譜聯用儀(GC/MS-QP2010,日本島津公司)和氣相色譜儀(GC/FID-2010PLUS，日本島津公司)分析蠟質成分。每個樣品設三個重復。

1.2.2 蠟質組分及含量測定

利用氣相色譜-質譜聯用儀 (GC-MS) 檢測小麥各個器官表皮蠟質成分的離子峰，然后檢索質譜數據庫(http://metlin.scripps.edu/index.php)鑒定表皮蠟質中各種化合物后得到標準樣品圖。利用氣相色譜-火焰離子化檢測儀 (GC-FID) 檢測蠟質成分的離子峰，使用LabSultion軟件積分后獲得峰面積，以內標的峰面積為標準分別對各種化合物定量分析。氣相色譜-質譜聯用儀 (GC-MS) 和氣相色譜-火焰離子化檢測儀 (GC-FID) 的檢測條件為：標準進樣量為1 L，設置進樣口溫度為280 ℃，調整分流比為5∶1，檢測器溫度為320 ℃；檢測程序如下：50 ℃保持2 min，以20 ℃· min-1升溫至240 ℃保持2 min，1.5 ℃· min-1升溫至320 ℃保持15 min。計算蠟質中各組分的相對含量。

相對含量=各組分離子峰面積/總離子峰面積

1.2.3 蠟質晶體觀察

將小麥各個器官的樣品用回形針分別固定在硬紙板上，將固定好的樣品放置在50 ℃烘箱中干燥備用。提前將導電膠粘貼在托盤上，將完全干燥的各個樣品切成2 mm×2 mm的正方形小塊，粘貼在導電膠上，抽真空后鍍金(E-1045,Hitachi)制樣,最后在場發式掃描電子顯微鏡(S-4800,Hitachi)上觀察各部位表皮蠟質的晶體結構。

1.2.4 葉片失水率檢測

選取抽穗期離體旗葉葉片(3片葉片為一組，設置3個重復)，將樣品放置黑暗環境中1 h使葉片上氣孔完全關閉，取出葉片后立即用千分之一天平稱重并計時，該質量為原始質量，時間點為0 h，而后分別在0.5、1、2、3、4、5和 6 h時間點稱重。各時間點的失水率為原始質量與各時間點處樣品質量之差與原始質量的比值。

1.3 數據分析

使用Excel 2007對數據進行整理，用DPS v 7.05軟件對數據進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 小麥不同器官表皮蠟質組分及其相對含量的差異

GC-MS和GC-FID分析結果顯示，兩小麥品種不同器官的表皮蠟質主要包含初級醇、脂肪酸、脂肪醛、烷烴、二酮、酯等脂肪族化合物(表1)。兩品種葉片表皮蠟質中初級醇的含量最高，相對含量為45.30%～76.87%。兩品種的穎殼表皮蠟質中二酮含量最高，相對含量分別為58.38%和84.21%。泰山4447的穗下莖和葉鞘表皮蠟質中烷烴相對含量最高，相對含量分別為50.04%和40.18%；二酮次之，相對含量分別為25.83%和26.56%。而濟麥6097的穗下莖和葉鞘表皮蠟質中二酮含量最高，相對含量分別為55.20%和 44.94%；烷烴次之，相對含量分別為28.03%和29.54%。這說明兩個品種表皮蠟質的組分一致，二者在各個器官中二酮和初級醇含量差異顯著，濟麥6097穗部、穗下莖和葉鞘等器官的表皮蠟質中二酮含量顯著高于泰山4447，而初級醇的含量則相反。

表1 泰山4447和濟麥6097不同器官中蠟質組分及其相對含量Table 1 Wax components and their relative contents on different organs of Taishan 4447 and Jimai 6097 %

表2 泰山4447和濟麥6097不同器官表皮蠟質的碳鏈長度分布Table 2 Carbon chain length distribution of wax on different organs of Taishan 4447 and Jimai 6097 %

同一行數據后不同大、小字母分別表示不同器官中蠟質相同組分在0.01和0.05水平差異顯著。TS：泰山4447；JM：濟麥6097。
Different capital and small letters following the values in same line indicate significant differences among different carbon chain length of components at 0.01 and 0.05 levels,respectively.TS：Taishan 4447;JM:Jimai 6097.

2.2 小麥不同器官表皮蠟質各組分鏈長的分布

經對兩小麥品種七個器官表皮蠟質的GC-MS分析和質譜數據庫檢索，一共鑒定出29種脂肪族化合物。初級醇主要是鏈長分布為C20～C32的偶數碳鏈醇；脂肪酸主要是鏈長分布在C20～C28的偶數碳鏈酸；脂肪醛主要是鏈長分布C22～C28的偶數碳鏈醛；烷烴主要是鏈長分布為C23～C33奇數碳鏈烷烴；二酮的碳鏈長度為C31，包含 β-二酮和OH-β-二酮兩種化合物及其同分異構體；酯是主要鏈長分布為C40～C48偶數碳鏈酯(表2)。

在不同器官表皮蠟質所含的初級醇中，C28醇相對含量在兩品種泰山4447和濟麥609葉片表皮蠟質中占有絕對優勢，相對含量分別為38.50%～69.00%和40.01%～70.95%。在不同器官表皮蠟質所含的烷烴中，C31烷烴的相對含量最高，在泰山4447和濟麥609中分別為5.49%～25.09%和3.52%～14.59%，且在泰山4447各個器官中的相對含量均高于濟麥6097。在兩個小麥品種不同器官表皮蠟質所含的二酮中，泰山4447的旗葉、穗下莖、葉鞘和穎殼中β-二酮含量與濟麥6097差異顯著，其中泰山4447和旗葉表皮蠟質、穗下莖和葉鞘中β-二酮含量分別為11.38%、23.80%和24.93%，在濟麥6097中分別為18.77%、40.24%和48.80%。兩個品種的脂肪族化合物鏈長一致，而含量差異主要體現在β-二酮。濟麥6097的表皮蠟質中β-二酮的相對含量顯著高于泰山4447。小麥各器官中表皮蠟質中脂肪酸、脂肪醛和酯相對含量較小，因而這些化合物碳鏈的占比也較少。

2.3 小麥不同器官表皮蠟質的晶體結構

從掃描電鏡觀察結果看，泰山4447和濟麥6097各器官蠟質晶體結構存在明顯的差異，其中兩品種的旗葉近軸面(圖1A、1E)、倒二葉(圖1C、1D、1G、1H)、倒三葉(圖1I、1J、1M、1N)和倒四葉(圖1K、1L、1O、1P)的蠟質晶體均呈現片狀結構；旗葉遠軸面(圖1B、1F)的蠟質晶體均呈現管狀結構；穗下莖(圖1R、1U)和葉鞘(圖1S、1V)的蠟質晶體均呈管狀結構；差異明顯的是泰山4447的穎殼蠟質晶體結構表現出管狀和片狀共存(圖1Q)，而濟麥6097的穎殼蠟質晶體則為單一管狀結構(圖1T)。

2.4 小麥品種旗葉的失水率差異

檢測結果顯示，泰山4447和濟麥6097的離體旗葉失水率均隨時間的增加呈明顯增加趨勢，在離體10 h至30 h兩個品種差異顯著，其中泰山4447和濟麥6097在離體30 h時的失水率分別為75.4%和68.2%(圖2)，說明泰山4447的旗葉水分非氣孔性散失快于濟麥6097。

圖2 泰山4447和濟麥6097旗葉的失水率Fig.2 Water loss rate of flag leaves of Taishan 4447 and Jimai 6097

3 討 論

植物表皮蠟質會因物種、組織器官及生長發育的不同而存在較大差異，同時會受到光照、溫度等環境的影響[5]。本研究通過GC-MS和GC-FID測定了兩個小麥品種抽穗期不同器官表皮蠟質的成分及含量，通過電鏡觀察各個器官表皮蠟質晶體結構。結果表明，泰山4447和濟麥6097的表皮蠟質主要由29種化合物組成，包含7種初級醇、5種脂肪酸、4種脂肪醛、6種烷烴、5種酯和2種二酮。不同器官之間表皮蠟質成分相似，但各成分相對含量存在顯著差異。汪 勇等[9,14]研究中發現，小麥葉片表皮蠟質中烷烴的占比最高，穗和鞘等器官表皮蠟質中二酮的占比最高。本研究中兩小麥品種在旗葉、倒二葉、倒三葉和倒四葉中烷烴含量最高,初級醇的含量次之，其中白霜狀表型濟麥6097的穗下莖、穗部和葉鞘中二酮含量最高，綠色表型泰山4447在穎殼表皮蠟質中二酮含量最高，但是在鞘和穗下莖表皮蠟質中烷烴含量高于二酮含量，且三個器官表皮蠟質中二酮含量與濟麥6097相比顯著降低。Adamskin等也認為，白霜狀表型小麥表皮蠟質中含有大量的二酮[12]。本研究中，綠色表型濟麥6097的穎殼、葉鞘和穗下莖外觀可見明顯的白霜，而倒二葉、倒三葉和倒四葉則沒有，二酮含量的差異可能是導致了不同器官表皮蠟質表型不同的主要原因。因此，濟麥6097和泰山4447表皮蠟質表型的差異也很可能由二酮的含量決定。植物蠟質層由填充于角質內的內層蠟質和覆蓋于角質層外的外層蠟質組成，一般內層蠟質呈無定形態，而外層蠟質會形成蠟質晶體堆積在角質層外，并受到蠟質成分和環境的影響[15]。在二穂短柄草[16]和節節麥[17]等植物葉片蠟質中因含有大量的初級醇而呈現出片狀晶體結構，而蠟質柱狀晶體含有大量的β-二酮、初級醇等化合物[6]。在本研究中，兩個小麥品種倒二葉、倒三葉、倒四葉、旗葉近軸面的蠟質晶體呈整齊的片狀結構，而倒二葉、倒三葉、倒四葉、旗葉近軸面的蠟質成分中初級醇的含量占比最高；旗葉遠軸面的蠟質晶體呈管狀結構，旗葉遠軸面的蠟質成分中二酮含量占比最高；穗下莖和葉鞘的蠟質晶體結構呈管狀，同時其蠟質成分中二酮含量占比最高，泰山4447的穎殼蠟質晶體出現片狀與管狀共存的現象，而濟麥6097的穎殼蠟質只有管狀晶體，這可能與其穗部蠟質成分中含有較高的初級醇有關。

A和E:泰山4447和濟麥6097旗葉的近軸面；B和F：泰山4447和濟麥6097旗葉的遠軸面；C和G：泰山4447和濟麥6097倒二葉近軸面；D和H：泰山4447和濟麥6097倒二葉遠軸面；I和M：泰山4447和濟麥6097倒三葉近軸面；J和N：泰山4447和濟麥6097倒三葉遠軸面；K和O：泰山4447和濟麥6097倒四葉近軸面；L和P：泰山4447和濟麥6097倒四葉遠軸面；Q和T：泰山4447和濟麥6097穎殼；R和U：泰山4447和濟麥6097穗下莖；S和V：泰山4447和濟麥6097葉鞘。A and E:Adaxial surface of flag leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; B and F:Abaxial surface of flag leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; C and G:Adaxial surface of top second leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; D and H:Abaxial surface of top second leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; I and M:Adaxial surface of top third leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; J and N:Abaxial surface of top third leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; K and O:Adaxial surface of top fourth leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; L and P:Abaxial surface of top fourth leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; Q and T:Glume surface of Taishan 4447 and Jimai 6097; R and U:Peduncle surface of Taishan 4447 and Jimai 6097; S and V:Leaf sheath surface of Taishan 4447 and Jimai 6097.

小麥器官表皮蠟質的合成與環境脅迫有著密切聯系。蠟質合成相關基因通過調控蠟質合成調整植物的抗逆性[14]；在擬南芥中 CER1基因的過表達可以提高蠟質成分的合成，進而擬南芥的抗逆性[18]； SLCER6基因參與蠟質合成中超長鏈脂肪酸的延伸，在番茄突變體中葉片和果實表皮蠟質成分的含量因基因突變而顯著減少，使番茄角質層失水率顯著增加，進而導致植株不育[19-20]。小麥各器官的蠟質晶體結構和蠟質成分含量與各器官的生物學功能有很大的關系，表皮蠟質中二酮的含量高低可影響植物外觀表型[21-22]，白霜狀的表型有助于防止植物的非氣孔性水分散失，并且蠟質含量與植物的抗旱性呈正相關[23]。本研究對小麥旗葉的生理檢測發現，蠟質含量較低的小麥品種旗葉擁有較高的失水效率。電鏡觀察結果表明，兩個品種表皮蠟質結構相似。氣相色譜-火焰離子化檢測 (GC-FID)發現，兩個品種旗葉的蠟質成分并不存在差異，而濟麥6097的旗葉相對于泰山4447有較高的蠟質含量，這進一步說明表皮蠟質影響了小麥葉片中水分的非氣孔性散失。