發酵調味品中血管緊張素轉化酶抑制肽的研究進展

李利軍，馬英輝，盧美歡

（陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

高血壓是目前威脅人類健康的主要疾病之一，治療高血壓的化學藥物日益顯現出較為明顯的副作用。血管緊張素轉化酶（angiotensin-convertingenzyme，ACE）是一種含鋅二肽羧肽酶，可以調節血壓，是引發人類患高血壓的主要因素之一[1]。它能將無升壓活性的血管緊張素I（angiotensin I，AngI）轉化為具有強升壓活性的血管緊張素II（angiotensin II，Ang II），同時會抑制有降壓作用的緩激肽的分解，從而導致人體血壓上升[2]。目前主要的ACE抑制藥物有卡托普利、依那普利、賴諾普利等。但易引起干咳，偶見血管神經性水腫等許多不良反應[3-4]。近年來，食源性的ACE抑制肽受到普遍關注，一般由幾個或幾十個氨基酸組成。理論上講，食物中的蛋白質水解后都可以產生多肽或低聚肽，包括含有ACE抑制活性的多肽，目前已有的報道主要來自于動物蛋白、植物蛋白和藻類蛋白等[5]。大豆蛋白是其中的重要原料之一。

1 微生物發酵法生產ACE抑制肽

與化學法相比，利用微生物發酵產生的ACE抑制肽具有成本低、無污染的優點，且所用菌種一般為可食用益生菌類，后期無需經過高度純化也能食用，因而成為研究的熱點。另外，微生物發酵法并不是單純依靠微生物所產的蛋白酶將底物分解，產生目標產物，而是能夠將酶解后釋放的小肽再經過微生物的修飾、轉移重組等作用，產生新的具有更優性質和更高應用價值的多肽[6]。

MAHTA M等[7]利用馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）發酵制備ACE抑制肽，獲得了氨基酸序列為Val-Leu-Ser-Thr-Ser-Phe-Pro-Pro-Lys的片段，其半抑制活性可達15.2 μmol/L；陳應運等[8]以蛤蜊為原料，采用納豆菌發酵制備ACE抑制肽，發酵產物對ACE抑制率達到80.49%；李風娟等[9]利用枯草芽孢桿菌發酵大豆，所產生的ACE半抑制率為0.312 mg/mL；李景[10]以豆粕為原料，利用米曲霉制備ACE抑制肽，抑制率可達到56.03%；李利軍等[11]以大豆分離蛋白為原料，利用枯草芽孢桿菌BS90進行發酵，發酵40 h，ACE抑制率達81.8%；LI Y等[12]篩選出Kluyveromyces marxianusZ17菌株發酵牛乳，并采用凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜分離純化出2種ACE抑制肽，其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分別為59.2 μg/mL、86.3 μg/mL。但是由于微生物發酵法的機理較復雜，反應進程不易控制，因此已有報道較少，多用于乳制品制備活性肽的研究中。而以蛋白為原料發酵的普通調味品中ACE活性抑制肽卻不被大家所關注。

2 發酵調味品中的ACE抑制肽

發酵調味品是采用微生物發酵的方法，生產的具有食品調味和佐餐功能的一類食品。近年來，生物技術的發展突飛猛進，腸道益生菌的研究，給酵素帶來巨大的市場空間。發酵調味品作為傳統發酵食品，所含有的各種生物活性物質也得到廣泛認可，其中ACE抑制肽成為關注熱點之一。

發酵調味品主要有醬油、食醋、豆腐乳、黃豆醬、甜面醬、蠶豆醬、郫縣豆瓣、豆豉等。其中醬油、豆腐乳、黃豆醬、豆豉均以黃豆為主要原料，經過微生物制曲、發酵產生氨基酸等鮮、香味物質而成。食醋、甜面醬分別以淀粉質原料為主，郫縣豆瓣以蠶豆為主要原料，經微生物制曲發酵而成。事實上，即使制醋所用的原料以淀粉質為主，也仍含較高的蛋白質。如玉米、大米、高粱、小麥粉、蠶豆等，理論上說，均可產生ACE抑制肽，調味品主料及蛋白質含量見表1。

表1 部分釀造調味品所用主料及蛋白質含量Table 1 Main raw material and protein content for partial brewing condiments

2.1 發酵調味品中常用菌種

發酵調味品常用的微生物主要是能夠產生蛋白酶的菌株，如米曲霉、毛霉、黑曲霉、酵母、枯草芽孢桿菌等。

米曲霉是發酵調味品中常用的生產菌，主要用于醬油、豆醬、豆豉等的釀造。李響等[13]研究了大豆分離蛋白作底物不同菌種的發酵作用，用肽含量和血管緊張素轉化酶（ACE）抑制率為檢測指標，分別對乳酸菌、霉菌和芽孢桿菌發酵后的產物進行ACE抑制活性測定，發現霉菌中具有較強ACE抑制活性的菌是米曲霉。其中曲霉菌分解大豆分離蛋白，使發酵液偏堿性，有利于大豆分離蛋白釋放ACE抑制肽。

毛霉主要用于豆腐乳的生產。杭梅等[14]利用毛霉菌接種到豆腐上保溫培養并發酵，采用乙醇為溶劑，進行提取，測定乙醇提取物的ACE抑制活性，發現到培養第5天時，活性最高?？莶菅挎呔饕糜诩毦远刽l酵，也有發酵豆醬等，種類較多，納豆菌也屬其中之一。酵母一般用于后熟發酵，起輔助發酵產乙醇的作用，發酵后期產生乙醇、丁醇等有機醇類，可以與有機酸反應，生成有機酯類，是醬香風味物質的來源，但未見報道酵母菌產ACE抑制肽的研究。乳酸菌一般在釀造發酵食品中都有發現，屬發酵過程自然伴生細菌，主要功能是完成乳酸發酵，產豐富的乳酸等有機酸，可以與醇類發生反應生成有機酯。萬月[15]利用德氏乳桿菌發酵還原脫脂乳，ACE抑制率可達65.2%。

2.2 常見發酵調味品

2.2.1 豆醬

豆醬一般以大豆為原料，常見的發酵豆醬用菌種有米曲霉、枯草芽孢菌等。大豆經過浸泡蒸煮、晾涼，接入菌種進行通風保溫制曲。然后加入食鹽水進行保溫發酵，制作而成。劉笑梅等[16]經發酵試驗發現，豆醬制作過程中，發酵技術參數對ACE活性抑制率有影響：加水量為175%，保溫50℃發酵12 d，效果最好。

劉婉璐等[17]研究了利用米曲霉為菌種，發酵制備豆醬時ACE抑制肽的活性變化情況，并分析了相關化學成分的變化，認為在發酵過程的前期，ACE抑制活性升高迅速，認為美拉德反應產物具有穩定后期樣品高活性的作用。

2.2.2 醬油

醬油是我國傳統調味食品。生產原料以大豆為主，菌種也多數采用米曲霉。一般經過原料處理、蒸熟變性、冷卻晾涼后接種制曲，然后加拌曲鹽水進行發酵。制作工藝主要有低鹽固態發酵法、原池淋澆發酵法、低溫稀醪發酵法。目前我國北方低鹽固態發酵法依然有很多企業采用，然而也有很多企業為了提高產品風味，已經改為原池淋澆發酵法。我國南方大部分地區醬油生產都采用低溫稀醪發酵法[18]。

日本的梅川逸人等[19]研究了日本溜醬油糟中的多肽對ACE的抑制及降壓作用，認為日本的溜醬油多肽含量高于濃口醬油，是濃口醬油的2倍，采用透析、脫鹽、凍干處理，精制后做成溜醬油糟多肽，ACE抑制作用明顯較高，在大白鼠高血壓模型（spontaneously hypertensive rat，SHR）的飼料中添加5 mg/kg就具有明顯的降壓效果。

李鳳娟等[20]分析了7種醬油產品中ACE抑制肽的活性。認為大豆蛋白水解程度與ACE抑制活性并非呈正比，可能與多種化合物綜合作用相關，有必要對其中的ACE抑制劑的結構特點進行更深入的分析。

2.2.3 豆豉

豆豉是中國傳統食品，中醫上淡豆豉入藥。豆豉以整粒大豆為原料，經蒸煮、制曲、發酵而成。所用菌種各不相同風味各異：有米曲霉、毛霉，也有用枯草芽孢菌的。

雖然國內這方面的研究較少，但故意無視或選擇性失明的現象卻非常多。例如，在鄉村學校中，老師有時會對調皮學生的一些行為故意無視，這種態度會使學生最終走上輟學的道路[15]。另外，在農民工受到不公平待遇時[16]，在報刊編輯工作中[17]，在企業管理中[18-19]，都存在故意無視或選擇性失明的現象。旅游中也存在這樣的問題。例如，后繼旅游開發商無視前開發商與當地居民因利益沖突而退出當地的情況，仍然限制居民的參與權，忽視居民的“決策”“經營”“享益”的權利[20]。

蘇現波等[21]對永川豆豉的理化指標、ACE抑制活性等指標進行了測定與評價，分別采用分光光度法和高效液相色譜法測定ACE抑制活性。結果顯示，不同廠家生產的豆豉產品，其營養、感官及功能活性等指標均有不同，技術參數對豆豉相關品質的影響需要進一步研究。

2.2.4 豆腐乳

豆腐乳是中國傳統發酵豆制品。在我國已有近千年的歷史，因味美，具有佐餐、助消化功能而深受海內外華人歡迎。主要以大豆為原料，先制作為密度較大的豆腐，然后切小塊再接種毛霉，待毛霉菌絲布滿整個豆腐小塊后，加鹽水及輔料進行保溫發酵。常見的有紅方、白方、青方等。

加工工藝對豆腐乳中的ACE抑制活性影響較大。馬艷莉等[22]研究了不同輔料和發酵參數對腐乳ACE抑制活性的影響，認為酒、紅曲和面曲的添加對豆腐乳中的ACE抑制活性都有影響，乙醇使其在后酵第5周達最大；紅曲作用在后酵第6周達最大；面曲的作用也是在后酵第6周達最大?？偟膩碚fACE抑制活性在腐乳制作的后期發酵過程中，表現為先升后降趨勢。

3 ACE抑制肽的分離純化技術

ACE抑制肽都是混合多肽中的小組分物質，所以進行分離純化是必不可少的環節。為了提高純度，對多肽混合物目前常用的分離純化方法主要有靜態吸附法、超濾法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法、高效毛細管電泳法、反相高效液相色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、質譜分析及氨基酸序列分析等方法。一般是先采用超濾處理，使不同分子質量的多肽混合物進行分離，再通過凝膠過濾色譜或者與離子交換色譜相結合達到進一步的分離，最后純化技術采用反向高效液相色譜（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）、毛細管電泳。

陳合等[23]采用超濾法初步純化，采用DA201-C型大孔吸附樹脂脫鹽，得到并富集具有ACE抑制活性的成分；鐘芳等[24]運用RP-HPLC、大孔吸附樹脂、凝膠過濾色譜法分離純化ACE抑制肽，其ACE抑制率達到96.92%；鄒基豪等[25]在綠豆中提取ACE抑制肽，用SephadexG-25凝膠柱色譜對酶解產物分離純化，純化后得到3個組分；刁靜靜等[26]采用模擬移動床（simulated moving bed，SMB）色譜技術產業化分離具有較高血管緊張素轉化酶（ACE）抑制活性的綠豆肽；毛跟年等[27]采用超濾、Sephadex G-25、Sephadex G-15及反相高效液相色譜對松仁清蛋白酶解液進行分離純化，對純化后樣品（組分D2）進行質譜結構鑒定。質譜結果進行從頭測序，篩選得到ACE抑制肽Tyr-Leu-Leu-Lys（YLLK），分子質量為535.34 Da。該肽經固相合成純度為99.80%，其半數抑制濃度測定值為0.282 5 μmol/L；毛跟年等[28]利用堿性蛋白酶解魔芋蛋白，制備ACE抑制肽粗品；通過超濾法除去大分子雜質，再經過Sephadex G-15柱層析分離，最后經過RP-HPLC純化，得到的魔芋ACE抑制肽純度較高；張瑩等[29]以豬皮水解液為原料，采用Sephadex G-15、半制備高效液相色譜分離純化膠原ACE抑制肽，獲得AP-I、AP-II兩個組分，IC50值分別為19.50 mg/mL、1.01 mg/mL；李開等[30]采用超濾、離子交換色譜和反相高效液相色譜對薏苡仁谷蛋白中的ACE抑制肽進行分離純化，最終獲得組分B2在質量濃度0.01mg/mL時，ACE抑制率為（73.41±1.05）%；上海師范大學的杜夢珂[31]從富硒堿性茶蛋白中也獲得了較高活性的ACE抑制肽。

另外，ACE抑制肽檢測方法大都采用體外檢測法，通過檢測血管緊張素I的模擬物馬尿酰組氨酰亮氨酸（hippurlyhistidyl-leucine，HHL）的產物馬尿酸的產量來反映ACE抑制肽的活性。目前，主要有紫外檢測法、可見分光光度法和高效液相法。分光光度法由于操作步驟繁瑣，導致結果誤差較大。高效液相色譜能夠準確的測定體系中馬尿酸的產生量，是近年來測定ACE抑制肽的主要方法。

吳瓊英等[32]用高效液相色譜法測定治療高血壓藥物卡托普利（Captopril）對ACE的抑制效率，以馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）為反應底物，反應生成的馬尿酸（hippuric acid，HA）為測定指標，利用直接進樣和等度洗脫的方法進行測定，該法中等度洗脫可使馬尿酸（HA）、組氨酰亮氨酸（histidyl-leucine，HL）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）良好分離，方便快捷。后又改進，利用高效液相色譜法測定ACE抑制肽的抑制率，更為簡捷、精密、準確。

近年來高效毛細管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE）[34]發展迅猛，是傳統電泳和現代微柱分離相結合的一種新型分離分析技術。具有時間短、分離效率高、檢測限低、進樣量小、溶劑消耗少、自動化程度高等優點，是高效液相色譜分析的補充。在蛋白質、氨基酸、有機化合物、藥物分離分析等方面極為重要，特別是在活性肽純度檢驗方面應用廣泛。

4 釀造發酵調味食品的發展趨勢展望

食源性的ACE抑制肽應是今后高血壓防治研究領域關注的重點。目前我國ACE抑制肽的研究較多，但較為分散，不夠系統，主要是在初級的制備、篩選、分離純化方面，真正應用所形成的產品很少，偶有也是以功能食品的形式出現，難以實現產業化[35]。

發酵調味品是我國傳統佐餐調味食品，原料富含蛋白質，選擇優良的高產菌并優化制曲、發酵工藝和相關關鍵技術參數，提高發酵調味品中的ACE抑制肽含量，開發出高抑制活性的低鹽腐乳、低鹽豆醬、低鹽醬油、低鹽豆豉等產品，既可以滿足群眾日常生活中食品調味佐餐的消費需求，還具有調節虛血壓的功能，使高血壓患者或潛在高血壓人群通過合理飲食就可以改善或調節血壓，減少那些潛在的發病患者，是未來產業發展方向。

隨著ACE抑制肽研究的不斷深入，對發酵調味品中ACE抑制肽的研究，應關注：（1）提高產品中ACE抑制肽的含量，開發具有降壓作用的釀造發酵調味食品；（2）采用計算機網絡技術對制備條件進行模擬和優化，提高生成率；（3）研究ACE抑制肽構象與功能的關系，優化小分子ACE抑制肽的化學合成途徑與技術；（4）構建基因工程菌，進行ACE抑制肽的大量表達；（5）開發具有ACE抑制肽功能的降壓發酵調味食品。

其實中國傳統的釀造發酵食品，歷史悠久，對人體有重要的健康促進作用，通過ACE抑制肽的研究，發現并弘揚傳統釀造產品的生理功能活性，帶動傳統產業升級換代具有重要意義。