微生物中蘋果酸脫氫酶研究現狀及展望

肖景惠，張慶芳，于 爽，逄 飛，遲乃玉，王夢雨*

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連 116622）

蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）是三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）中重要的氧化還原酶，催化L-蘋果酸脫氫變成草酰乙酸的酶。至今已有多種MDH得到分離純化并獲得晶體結構[1]。根據MDH亞細胞定位、輔酶特異性以及功能的不同，MDH被分為三大類：第一類是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）-線粒體蘋果酸脫氫酶（mitochondrial malate dehydrogenase，mMDH）類型，主要參與真核微生物線粒體中的三羧酸循環或乙醛酸循環；第二類是NAD-胞質蘋果酸脫氫酶（cytosol malate dehydrogenase，cMDH）類型，主要參與原核生物細胞質中的TCA循環或乙醛酸循環，并且參與真核微生物細胞質蘋果酸-天冬氨酸穿梭途徑，負責將細胞質中還原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）的H+傳遞給草酰乙酸，使草酰乙酸轉變為蘋果酸[2]。第三類是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）NADP-MDH類型，主要存在于谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）和黃曲霉屬微生物[3]。除以上類別的MDH外，研究發現古細菌中的MDH對NAD+和NADP+都具有親和力[4]。動力學特性分析顯示，細胞質MDH活性高于線粒體MDH，而線粒體MDH活性高于細胞質MDH，且不同細胞器中的MDH有各自不同的生理作用[5]。研究發現，在真核微生物中，MDH只有同源二聚體一種結構形式[6]，但除了部分革蘭氏陽性菌和古細菌中的MDH以四聚體形式存在外[3]，在大部分細菌的MDH以同源二聚體形式存在[7]。

MDH除進行氧能量代謝作用外，還參與C4循環，糖異生，脂肪酸的氧化，氮同化，氨基酸的合成等各種代謝活動[8]。由于其在多種生化代謝中發揮作用，MDH廣泛應用于心肌梗塞、急性實質性肝損傷、肝癌、肺癌的早期診斷，是常用的臨床診斷用酶，并在生物制藥、化工檢測等領域也具有廣泛應用。該文介紹了微生物中MDH的蛋白結構、催化機制以及活性調節，并對其酶學性質、醫療診斷及免疫領域的應用、工業領域的應用以及生產方面，闡述了蘋果酸脫氫酶的研究進展，以期為蘋果酸脫氫酶的進一步開發和利用提供參考。

1 微生物蘋果酸脫氫酶的三級結構

研究表明[9]，MDH的氨基酸序列在一級結構上表現出較低的相似性，多數相似性不到20%。結合核酸、催化底物以及與亞基的界面結構相關的幾個功能性結構會由較少的幾個保守的殘基決定。但與較低的氨基酸序列相似不同，原核微生物和真核微生物MDH的晶體結構非常相似[10]，MDH的晶體結構見圖1。

圖1 蘋果酸脫氫酶的三維結構[9]Fig.1 Three-dimensional structure of malate dehydrogenase

2 微生物蘋果酸脫氫酶的催化機制

酶動力學研究顯示[11]，MDH所催化L-蘋果酸與草酰乙酸的反應過程中，MDH先結合NAD（H）+，再結合二羧酸底物蘋果酸或者草酰乙酸。MDH催化蘋果酸羥基的H+定向地結合到NAD（P）+，實現L-蘋果酸與草酰乙酸二者之間的可逆轉換。

不同來源的MDH一級結構氨基酸序列相似性較低，但輔酶結合位點、核苷酸結合位點及催化活性位點高度保守[12]。其中MDH每個亞基的N端為輔酶核苷酸結合結構域（structurally domain），C端結構域是底物結合位點和催化位點在內的功能域（functionallydomian）。這兩個結構之間的疏水裂縫存在MDH的活性中心，包含了底物和輔酶的結合位點[8]。當MDH與底物或輔酶在其特異性活性位點通過疏水性結合形成蛋白復合物，蛋白質構象發生改變，MDH空間的改變使得底物能夠被最小化暴露在溶劑中并識別其附近的關鍵位點。其中三種關鍵的氨基酸殘基分別為組氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）和精氨酸（Arg），屬于催化基團。在這個變化過程中，His與Asp結合形成離子對，位于活性中心，在反應過程中提供質子，Arg則主要起保護底物的作用[7]。具體機制見圖2。

圖2 蘋果酸脫氫酶的催化機制[13]Fig.2 Catalytic mechanism of malate dehydrogenase

3 MDH活性調節

MDH活性受反饋抑制的調節，過量的草酰乙酸和NADH強烈抑制MDH活性。SETOYAMA C等[14]研究發現，來自閃爍古生球菌Archaeoglobus fulgidus，Salinibacter ruber和多糖孢菌Saccharopolyspora erythraea的MDH活性可以被高濃度草酰乙酸所抑制，當紅霉菌在果糖中生長時，MDH活性在培養72 h達到最大值，而MDH在葡萄糖為碳源的培養過程中保持穩定。THOMPSON H等[15]研究發現，在產甲烷古細菌（Methanogenic archaea），嗜熱古細菌（A.fulgidus）和大腸桿菌（Escherichia coli）中，NADH具有相同的抑制作用。此外，碳源的種類也是MDH活性調節的因素之一：MOLENAAR D等[16]研究發現，在谷氨酸棒桿菌中，MDH的活性均對以淀粉與蔗糖為碳源起反應，其中MDHs的活性分別比以葡萄糖為碳源時高3.4倍和3.1倍。在一些微生物中，MDH可與TCA循環中的其他酶相互作用，來促進底物與底物結合，從而增加活性。BARTHOLOMAE M等[17]在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中研究發現，MDH與兩種TCA循環酶：異檸檬酸脫氫酶和檸檬酸合成酶相互作用，酶活力大幅度提高。

4 微生物蘋果酸脫氫酶的酶學性質

4.1 最適pH值

MDH廣泛存在于自然界生物體內，具有較大的pH適應范圍，研究顯示在pH2.0～11.5范圍內，MDH都具有一定的活性[18-20]。酵母的MDH在pH 8.1的時候酶活力最高，金霉素鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）的MDH最適pH一般在9.0左右，在假單胞菌（Pseudomonas）中，MDHs氧化蘋果酸的最適pH為10左右[18]。李倩[19]以大腸桿菌基因組為模板克隆表達的MDH，在pH 2～6的范圍內，其酶活比較穩定。劉俊[20]從嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）HB27基因組中克隆了MDH的基因，并在大腸桿菌中成功地表達，純化的酶具有pH的偏好性。在堿性環境中相對較穩定，它的最適反應pH值為11.5。結果表明，MDH具有較大的pH適應范圍，且不同菌種中MDH的最適pH值具有顯著差異。

4.2 最適溫度及熱穩定性

研究表明，大部分的MDH在溫度為37～65℃范圍內，都具有一定的活性[11-12]。如深黃被孢霉（Mortierellaisabllina）的MDH在37℃時酶活最高并較為穩定[11]；大腸桿菌的MDH的最適反應溫度為37℃。MDH在42℃以下較穩定，水浴保溫1 h后酶活能保留50%以上[19]；枯草芽孢桿菌的MDH最適溫度約為50℃，但MDH的熱穩定性較差，嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）的MDH在65℃有較好的穩定性并且酶活最高[12]。在趨向較高或較低溫度時，大多數種屬的MDH活力都有降低的趨勢。而極端環境下的微生物在低溫或高溫環境中依然可以保持較高活力。研究表明[20-21]，MDH的熱穩定性與氫鍵數目、鹽橋數目以及分子內部結構有關，增加二硫鍵或氫鍵可以改善MDH的熱穩定性。如嗜熱細菌Chlorobium tepidum和嗜溫細菌Chlorobium vibrioforme的MDH熱穩定存在差異，是由于嗜熱細菌MDH的極性氨基酸殘基在亞基之間形成更多的氫鍵。此外，研究顯示醇類物質對MDH的熱穩定也有一定程度的影響。在低溫環境下，甘油可以作為維持MDH活性的優良穩定試劑。在高溫環境下，環多醇和山梨醇能夠有效維持MDH的活性。這可能是由于羥基基團和酶分子的相互作用，從而加強了MDH分子的疏水作用，使MDH受水分子的影響減小，進而提高了其熱穩定性。

4.3 金屬離子對MDH影響

通過對大腸桿菌MDH的影響研究表明[22]，不同的金屬離子對MDH活性的影響具有特異性。K+對酶活有明顯的提高作用，Fe3+、Co2+和Ni2+對酶活的提高作用次之，Ca2+、Ba2+和Mg2+對酶活影響小。而Pb2+、和Cu2+表現出不同程度的抑制酶活作用，Ag2+、Hg2+和Zn2+對酶活有強烈的抑制作用。尤其需要提到的是，Ag2+和Hg2+抑制水平最強烈，當金屬離子濃度為1 mol/L時，97%的MDH活性受到抑制。對嗜鹽古菌的MDH研究顯示[23]，當電荷密度高時，MDH的折疊結構能被陰離子能有效穩定，而在低鹽濃度下，MDH的折疊結構能被陽離子穩定，發揮與前者相同的作用。

5 微生物蘋果酸脫氫酶的應用

5.1 醫療診斷及免疫領域的應用

MDH可測定血清中門冬氨酸氨基轉移酶的活性以及血清中總CO2的含量，廣泛用于心肌梗塞，急性實質性肝損傷，肝癌，肺癌的早期診斷。MDH作為一種重要的代謝酶，其作用并不局限于代謝調節，其還可與p53蛋白相互作用，影響腫瘤細胞周期、衰亡和凋亡[24]。此外，真菌MDH還可作為可篩選抗原表位和靶基因在疫苗開發和分子生物學診斷中得到了深入研究。董永亮[25]研究發現，布魯氏菌的MDH是免疫原性蛋白，MDH抗體對布魯氏菌入侵細胞有明顯的抑制作用，推測MDH參與了布魯氏菌入侵與黏附宿主細胞過程，這為布魯氏菌相關診斷、治療藥物及疫苗的研發提供了理論基礎。此外，鐘毅[26]研究發現，白念珠菌耐藥株MDH蛋白表達量低于敏感菌株，表明其表達水平與菌種耐藥性存在一定關系，可作為白念珠菌感染人體的特異性檢測靶點。HERNANDO F L等[27]研究發現，致病念珠菌病人感染血清可與白念珠菌抗原結合，而在正常人對照中沒有此現象。綜上所述，MDH是一種重要的醫學診斷用酶，并且在疫苗研發和基因檢測領域具有廣闊的應用前景。

5.2 工業領域的應用

工業方面，MDH主要可應用于發酵過程中L-蘋果酸、醋酸、檸檬酸的等有機酸的檢測。

5.2.1 定量測定L-蘋果酸

L-蘋果酸廣泛存在于各種酒制品、面包、果汁以及菜蔬制品中，是果酸中的最重要的成分之一。對于葡萄酒和啤酒的釀造工業中，L-蘋果酸和L-乳酸是兩項極為重要的監測指標。在葡萄酒和啤酒的發酵過程中，需要對發酵液中的L-蘋果酸含量進行實時監測[28]，在生產中，要對發酵進程進行全程監控。

在L-蘋果酸脫氫酶（MDH）的催化作用下，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）氧化L-蘋果酸，隨后生成草酰乙酸，然后在反應體系中加入過量的L-谷氨酸，并在谷草轉氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase，GOT）的作用下，生成L-天門冬氨酸和2-酮戊二酸。利用上述（1）、（2）式進行偶聯反應，以及在波長340nm處，NADH有特異性的吸收峰的特點，通過測定反應體系在波長340 nm處吸光度值的增加值，得到樣品中L-蘋果酸的含量。

5.2.2 定量測定發酵液中的醋酸[29]

醋酸作為工業生產中極其重要的影響參數，廣泛存在于食品、飲料果汁、造紙、制藥等其他工業產品中。因此，能夠準確測定工業生產中醋酸的含量是關鍵。MDH便可以作為輔酶用于對其含量的測定。

在乙酰輔酶A合成酶（acetyl-coenzymesynthetase，ACS）催化作用下，輔酶A催化醋酸轉化為乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA），并生成腺嘌呤核糖核苷酸（adenineribonucleotide，AMP）和焦磷酸，在乙酰輔酶A的作用下，乙酰輔酶A催化草酰乙酸生成檸檬酸，反應中的草酰乙酸是由L-蘋果酸與NAD+在L-MDH催化下產生，其中NAD+被還原成NADH，生成的NADH的量與醋酸的量成正比，通過在波長340 nm條件下測定NADH的吸光度值計算醋酸的含量。

5.2.3 定量測定發酵液中的檸檬酸[30]

檸檬酸是一種常見的酸化劑，歐盟規定工業上酸化劑使用濃度的最高上限為1 g/L。同時，檸檬酸也可作為食用香料和防腐劑，現已經被廣泛的應用于食品、果汁飲料、肉制品、造紙以及制藥等工業生產中。此外，檸檬酸也是臨床檢驗的一項重要指標。

在檸檬酸裂解酶（citratelyase，CL）的催化作用下，使檸檬酸生成了草酰乙酸和醋酸。生成的草酰乙酸在L-MDH和NADH的共同作用下，生成L-蘋果酸和NAD+。如果所測樣品中存在草酰乙酸脫羧酶，一部分草酰乙酸在該酶的催化作用下轉化生成丙酮酸。為了更加準確的測定檸檬酸的含量，需要使用D-LDH催化丙酮酸轉化為D-乳酸和NAD+，生成的NAD+與檸檬酸的含量成反比，通過在波長340 nm處測定NADH吸光度值變化計算出檸檬酸含量。

6 微生物蘋果酸脫氫酶的生產

微生物由于具有來源廣泛、生長周期短等優點，是理想的MDH生產來源?，F階段，研究者一方面通過菌株誘變、優化菌株發酵條件等方法，獲得MDH高產菌株；另一方面，通過基因重組等方法獲得MDH高產菌株，并深入研究MDH的理化特性。BROWN S H等[31]在米曲霉（Aspergillus oryzae）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevusiae）等微生物中，成功地高表達MDH，并發現其可以提高D-蘋果酸的產量。劉俊[20]從嗜熱菌株HB27中克隆獲得Tt-MDHs基因，并在大腸桿菌中成功表達，并獲得了高純度并具熱穩定的MDH蛋白。李倩[19]以大腸桿菌基因組為模板，分子克隆了939bp的MDH基因表達重組菌，獲得比酶活高達112.5U/mg的高產菌株。王俊[6]通過對深黃被孢霉的MDH基因的cDNA序列進行克隆，研究發現該MDH是一個新的蘋果酸脫氫酶基因，重組蛋白酶活為379.28 U/mg。以上研究工作為微生物MDH產業化制備提供了大量參考。

7 展望

MDH作為生物體中心代謝途徑的關鍵酶，在遺傳變異和個體發育等具有重要的研究價值[25]，并在臨床診斷、工業檢測具有廣泛應用，市場需求量與日俱增，價值巨大。自上世紀50年代，就已經有學者從動物心肌中分離出MDH?，F階段，市場上商業化的MDH來源主要是從豬、兔、牛的心肌、肝臟、骨骼肌中提取。原料成本低、來源廣，但提取工藝繁瑣，產品酶活較低。因此，深入了解微生物MDH的生化特性、結構功能及催化機制，構建具有高活力的MDH表達工程菌，優化生產菌種發酵條件具有重要研究意義和應用價值。