RAPD分子標記技術在大豆育種中的應用

林文磊 呂美琴 李明松 康蓉蓉 曾紅英 姚文 蔡錦玲 葉玉珍

摘 要： 為了更好地引導分子標記技術應用到大豆輔助育種當中，綜述了RAPD分子標記技術在大豆遺傳多樣性分析、抗病基因研究、農藝性狀研究中的應用，旨在為把該技術應用于輔助培育高產、高蛋白質含量的大豆新品種提供理論依據及指導。

關鍵詞： RAPD分子標記;大豆育種;高蛋白

DOI：? 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.09.015

Application of RAPD Molecular Markers on Soybean Breeding

LIN Wen-lei1， LV Mei-qin1， LI Ming-song1， KANG Rong-rong1，ZENG Hong-ying1， YAO Wen1， CAI Jin-ling1， YE Yu-zhen2

（1. Quanzhou Institute of Agricultural Sciences， Quanzhou， Fujian 362212;2. Chengjiao Town Agricultural Technique Extension Station of Mingxi County， Sanming， Fujian 365200）

Abstract：? In order to apply the technique of RAPD molecular markers in assisted breeding of soybean， the paper reviewed the application of RAPD molecular markers technique in genetic diversity analysis， diseases-resistant genes investigation and agronomic characters of soybean so as to provide theoretical basis and guidance for application of RAPD molecular markers in assisted breeding of high yield， high protein content soybean varieties.

Key words：? RAPD molecular markers; soybean breeding; high protein content

大豆Glycine max（L.） Merrill起源于我國，是重要的糧食和經濟作物，也是重要的飼料和輕工業原材料。隨著生活水平的不斷提高，人們越來越注重飲食健康，大豆成為獲取植物蛋白及食用油的重要來源之一[1] 。然而，目前我國的大豆存在產量較低、品質較差等缺點，無法滿足國內逐年增長的大豆需求，導致大豆進口量逐年增加，而進口大豆主要為轉基因大豆。因此，非常有必要大力發展國產的優質非轉基因大豆，主要是在提高大豆產量、改善品質、增強抗性、縮短育種年限等方面下功夫[2] 。

育種的本質就是將盡量多的優良性狀集中于同一個品種上。傳統的育種依賴于植株表型的選擇，易受環境條件影響，具有周期長、預見性低等缺點。近年來，植物生物技術迅速發展，分子生物技術彌補了傳統育種方法的不足，PAPD分子標記技術具有簡單、便捷等優點被廣泛應用于大豆輔助育種工作之中，提高了育種效率[3] 。

1 RAPD技術簡介

分子標記輔助選擇（Molecular-marker Assisted Selection，MAS）是利用分子標記與目標性狀基因緊密連鎖或共分離的特性，通過檢測分子標記，間接檢測目標基因的存在，從而達到選擇有目標性狀的個體，它不受個體生育期階段、環境條件、器官組織差異等的影響，也不受基因表達與否的限制，選擇目標個體更加準確、可靠[4-6] 。

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA）是一種在PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應）技術的基礎之上，以不同個體基因組DNA作為模板，以一系列隨機排列的十堿基寡脫氧核苷酸單鏈為引物，在特定的條件下進行擴增，經凝膠電泳獲得多態性譜帶，進而分析不同個體間的差異的分子技術[7] 。該技術可對完全未知任何分子生物學資料的物種基因組DNA進行分析，一套引物可用于不同生物的研究，具有簡便、快速、成本低、靈敏度高、所需DNA模板量少等優點，對于研究親本材料的遺傳背景、選配雜交親本具有較高的可靠性[8] 。

2 RAPD技術在大豆研究中的應用

2.1 遺傳多樣性分析

生物遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是生物遺傳信息的總和。對遺傳多樣性的研究可以了解物種的起源、種源的適應性、基因資源分布等問題[9] 。豐富的大豆種質資源是選育優良大豆品種的物質基礎，研究大豆種質資源的遺傳多樣性，可為大豆選育工作提供理論依據。

張志永等[10] 對28份栽培大豆種質資源進行RAPD分析，結果表明聚類分析結果與種質資源間的親緣關系、地理分布相吻合。陳艷秋等[11] 對146份大豆材料進行RAPD分析，結果表明供試大豆材料相互間的遺傳距離介于0.703～0.959，可聚成3類。周延清等[12] 對10份河南栽培大豆品種進行RAPD分析，結果表明這些品種間的遺傳相似系數介于0.528～0.776，可聚成3類。王振東等[13] 對45份不同抗旱程度的大豆種質資源進行RAPD分析，研究表明45份大豆種質間的遺傳相似系數介于0.381 8～ 0.903 8 ，在遺傳距離為0.38處，可聚為3大類，聚類結果表明品種間關系與表型形態、地理起源等具有一定的相關性。

2.2 抗病基因研究

大豆病害往往會嚴重影響大豆產量和品質，有些病害甚至會造成大豆絕產，而培育和種植抗病大豆品種是預防大豆病害最安全、經濟、有效的途徑[14-15] 。隨著分子標記技術的快速發展，已經鑒定出很多與大豆抗某種病害的基因緊密連鎖的標記。

大豆花葉病毒?。⊿oybean mosaic virus，SMV）是大豆的一種世界性病害，會導致減產及種子質量退化。目前，關于大豆抗SMV是由幾對基因控制的，是顯性基因還是隱性基因，亦或是顯性基因和隱性基因共同控制的，這些問題尚無定論[14，16-19] 。國外學者已命名了4個抗SMV基因位點：Rsv1[20] 、Rsv2[21] 、Rsv3[22] 和Rsv4[18] 。通過分子標記技術已經發現很多與抗SMV基因連鎖的標記，包括與Rsv1緊密連鎖的RFLP、SSR、AFLP標記[23] ，與Rsv3緊密連鎖的RFLP標記[24] ，與Rsv4緊密連鎖的RFLP、SSR標記。張志永等[25] 研究表明，對大豆SMV強毒株系Sa的抗性由單顯性基因Rsa控制，并獲得2個重復性較好的RAPD標記OPW05 660bp? 和OPAS06 1800bp? ，它們與該基因的連鎖距離分別為22.2 cM和10.1 cM。東方陽[26] 的研究結果表明，特異RAPD標記與抗SMV毒株系Sa、Sc有關的抗性基因的連鎖距離分別為16.1 cM和9.7 cM。吳俊江等[27] 的研究獲得8個可能與抗SMV1號株系的抗性基因連鎖的RAPD標記。鄭翠明等[19] 的研究獲得與抗SMV3號株系的基因緊密連鎖的共顯性RAPD標記OPN11 980bp/1070bp? ，遺傳距離為2.1 cM。劉麗君等[28] 對黑農39（高抗）×合豐25（高感）的F 2群體進行RAPD分析，獲得與抗病基因連鎖的共顯性標記OPN 1400bp/1300bp? ，連鎖距離為8.2 cM。

大豆孢囊線蟲?。℉eterodera glycines Ichinohe，SCN）又稱大豆根線蟲病、黃萎癥，目前，在我國主要有1、2、3、4、5、6、7、9和14號生理小種[29-30] 。章彥等[31] 的研究獲得5個與SCN抗性密切相關的特異RAPD片段，分別為BRC173 1600bp? 、BRC182 900bp?? 、BRC185 800bp? 、BRC 185 850bp? 、BRC190 1300bp? 。 王慧等[32] 的研究獲得1個與SCN抗性有關的RAPD標記S11 700bp? 。王永軍等[33] 以經過抗性遺傳分析的BC 1F 2分離群體為材料，發現1個與SCN1號生理小種抗性基因連鎖的RAPD標記OPA19 1200bp? 。Skorup ska[34] 和Mahalingam[35] 的研究分別獲得17個和4個與抗SCN3號生理小種的基因緊密連鎖的RAPD標記。顏清上等[36] 以6份高抗SCN和2個高感SCN的大豆種質資源為材料，進行RAPD分析，引物OPG04擴增出1條只有抗病資源特有的特異DNA條帶，推測這段DNA可能與抗SCN4號生理小種的抗性有關。Choi等[37] 的研究獲得抗SCN3、5、14號生理小種的RAPD標記。

大豆灰斑?。‵rog-eye leaf spot，FLS）是一種由大豆灰斑病菌Cercospora sojina引起的世界性病害，在我國黑龍江省發生最為嚴重?，F已確定3個顯性抗病基因Rcs1、Rcs2、Rcs3。目前，我國已鑒定的大豆灰斑病菌生理小種有11個[38] 。鄒繼軍等[39-40] 通過研究東農91212（感C.sojina 7號生理小種）×東農9674（抗所有生理小種）的抗性遺傳分析，表明對7號小種的抗性由單顯性基因控制，并命名為Rcsc7，研究獲得3個RAPD標記OPQ12 500bp? 、OPS03 620bp? 、OPA04 1100bp? ，與該抗病基因的連鎖順序為OPQ12 500bp? Rcsc7 OPS03 620bp?? OPA04 1100bp ，遺傳距離分別為17.3、8.7、33.2 cM。武小霞[41] 的研究獲得1個顯性RAPD標記OPC08 831bp? ，該標記與Rcsc7基因的遺傳距離為25.59cM。董偉等[42] 對東農87 104（高感品種）× 東農9674（高抗品種）的F 2群體進行RAPD分析，研究結果獲得與C.sojina 1號生理小種緊密連鎖的3個特異標記：OPK03 840bp? 、OPM17 1700bp? 、OPO10 950bp? ，與抗病基因Rf1的連鎖順序為OPK03 840bp??? Rf1 OPM17 1700bp?? OPO10 950bp? ，遺傳距離分別為：10.4、13.8、26.1 cM。

大豆疫霉根腐?。≒hytophthora Root Rot，PPR）是由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起的一種土壤性病害，在大豆整個生育期中都能侵染并造成大幅度減產?，F已報道的16個抗大豆PPR的基因，分布于9個不同的位點上，9個不同的連鎖群上[43-47] 。Bhattacharyya等[48] 對近等基因系（Willoams和William82）進行RAPD分析，結果表明，特異引物OPRK15與大豆PPR抗性基因Rps1 k緊密連鎖。曲娟娟等[49-51] 以大豆PPR（Phytophthora megasperma）2對近等基因系（Williams與Williams79、Williams與Williams82）為材料，對其基因組DNA進行RAPD分析，研究結果推測，顯性RAPD標記OPQ04 700bp? 、OPH05 1600bp/640bp? 分別與大豆PPR抗性基因Rps1 c 、Rps1 k 連鎖。Byrum等[52] 的研究結果表明，特異RAPD標記OPB11 861bp? 與抗性基因Rps4緊密連鎖。

2.3 農藝性狀研究

一個優良的大豆品種除了應該具備抗病性，還應該同時有一些好的農藝性狀，例如產量高、油脂含量高、分支數多、單株莢數多、抗干旱、耐鹽等。

劉昭君等[53] 對黑農小粒豆（低油）與墾農18（高油）的雜交F 2、F 3群體進行RAPD分析，找到4個與高油含量相關的特異DNA標記S56 900bp? 、S61 600bp? 、S107 600bp/450bp/370bp 、S134 450bp/500bp ，這些標記的重復性好，可用作鑒定大豆高油含量的分子標記。王慧等[54] 對12份黃色種皮和11份黑色種皮的大豆種質資源進行RAPD分析，發現了一個與大豆黃色種皮相關的特異DNA片段S79 500bp? ，而且該標記具有較高的重復性和穩定性，可用于輔助選擇優良的黃色種皮大豆新品種。黃方等[55-56] 的研究表明RAPD標記S1 1900bp? 與控制大豆短葉柄的基因的遺傳距離為14.36 cM，標記S506 1500bp? 與控制大豆曲徑的基因的遺傳距離為6.94cM。朱保葛等[57] 對經過烷化劑EMS誘變處理得到的4粒莢和窄葉穩定突變系E182進行RAPD分析，研究結果表明，特異標記OPY5 1300bp? 與窄葉突變基因的遺傳距離為8 cM。黃福龍[58] 以62對大豆細胞質雄性不育系及相應保持系為材料，用11個隨機引物對其mtDNA進行RAPD分析，通過對特異片段的分析推斷，大豆細胞質雄性不育可能與Cox I基因及其上游調控序列的插入和缺失有關。

3 存在的問題及展望

我國大豆種質資源極其豐富，栽培地區遍布全國各地。大豆栽培種的形態與經濟性狀受地理位置、地域氣候、土壤、光照等自然條件的影響，僅僅根據大豆的經濟性狀與形態進行分類，有可能造成將不同基因型誤歸為同一品種，或將同一基因型誤歸為不同品種的結果。與傳統育種方法相比，RAPD分子標記技術具有簡單、便捷等優點，在保證DNA純度，并嚴格控制PCR反應條件的前提下，其重復性高，可獲得清晰穩定的電泳條帶，可用于大豆分子研究分析，這為輔助挑選優質的大豆親本提供理論依據，可大大縮短育種年限并提高選擇準確率。

目前，我國在生產上缺乏高蛋白含量的大豆品種，迫切需要利用分子輔助育種技術改良現有的大豆品種，以期選育出高產、高蛋白的優良大豆新品種。關于大豆蛋白質方面的研究主要集中在蛋白質品質、結構、含量等[59-60] 方面，而應用于大豆蛋白研究中的分子標記技術，主要有利用SSR[60-65] 、RFLP[66-67] 、SNP[68-69] 技術進行分析，RAPD在蛋白質含量方面的研究仍未見報道。

RAPD分子標記技術是一種顯性標記，無法確定所研究的個體是純合體還是雜合體，同時，由于引物序列短，退火溫度較低，該標記容易受PCR擴增時的溫度影響，可將其轉化為SCAR（Sequence Characterized amplified regions，特定序列擴增）標記，克服RAPD標記的缺陷，提高目標性狀基因檢測的準確性，從而達到高效地輔助選擇育種的目的。

后續將挑選高蛋白含量與低蛋白含量的大豆種質資源，利用RAPD技術進行分析，期望能找到與大豆蛋白質含量相關的特異RAPD標記，以輔助選擇高蛋白含量的大豆種質，縮短育種年限。

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