基于Notch信號通路探討針刺曲池、足三里對MCAO大鼠的神經保護機制

于雪萍 袁秀麗

摘要 目的：觀察針刺曲池穴及足三里穴對MCAO大鼠的行為學干預效應，同時評價其對Notch信號通路標志性蛋白的影響。方法：將36只SD大鼠隨機分成空白組、模型組及針刺組，各12只。模型組及針刺組大鼠均接受改良線栓法建立左側大腦中動脈局灶性缺血（MCAO）再灌注模型，空白組大鼠僅進行血管分離術，術后空白組及模型組大鼠每日接受模擬捉拿1次，針刺組大鼠予針刺曲池穴及足三里穴，連續干預14 d，用神經行為學評分評估大鼠行動能力，TTC染色法觀察腦梗死體積變化，HE染色法觀察大鼠腦組織細胞形態和結構，Western blotting法檢測各組大鼠腦組織Notch1、Hes1蛋白表達變化。結果：1）與模型組比較，針刺組大鼠神經行為學評分明顯提高，并縮小了腦梗死體積;2）針刺可明顯改善MCAO術大鼠腦組織細胞形態和結構;3）Western blot結果顯示針刺可明顯上調大鼠腦組織Notch1、Hes1的蛋白水平。結論：電針曲池穴及足三里穴可改善MCAO大鼠行為能力，其作用機制可能與介導Notch通路有關。

關鍵詞 局灶性腦缺血;針刺;曲池穴;足三里穴;Notch信號通路

Mechanism for Neuroprotection against MCAO Rats of Acupuncturing at Quchi （LI 11）

and Zusanli （ST 36） based on Notch Signaling Pathway

Yu Xueping1， Yuan Xiuli2

（1 Sichuan College of Traditional Chinese Medicine， Mianyang 621000， China; 2 Mianyang City Hospital

of Traditional Chinese Medicine， Mianyang 621000， China）

Abstract Objective：To observe the behavioral effects of acupuncture at Quchi （LI 11） and Zusanli （ST 36） acupoints on MCAO rats and to evaluate the effects on Notch signaling pathway marker proteins. Methods：A total of 36 SD rats were randomly divided into blank group， model group and acupuncture group， with 12 rats in each group. The rats in the model group and the acupuncture group received the modified suture method to establish the model of left middle cerebral artery occlusion （MCAO） reperfusion. The rats in the blank group were only subjected to vascular segmental surgery. The postoperative blank control group and model group rats were subjected to simulated catching once a day. Rats in acupuncture group were given acupuncture at Quchi and Zusanli points for continuous intervention for 14 days. Neurobehavioral scores were used to assess the ability of rats to exercise. TTC staining was used to observe changes of cerebral infarction volume. HE staining was used to observe morphology and structure of rat brain cells. The expression of Notch1 and Hes1 protein in brain tissue of each group was detected by Western blotting. Results：1） Compared with the model group， neurobehavioral score of acupuncture group was significantly increased and the volume of cerebral infarction was reduced; 2） Acupuncture significantly improved the morphology and structure of brain cells in MCAO rats; 3） Western blotting results showed that acupuncture significantly increased the protein levels of Notch1 and Hes1 in rat brain. Conclusion：Electroacupuncture at Quchi and Zusanli points can improve the behavioral abilities of MCAO rats， which may be related to the mechanism of Notch pathway.

Key Words Focal cerebral ischemia; Needling; Quchi （LI 11）; Zusanli （ST 36）; Notch signal pathway

中圖分類號：R245.3文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.037

運動功能障礙是缺血性腦卒中最常見的后遺癥，嚴重制約了患者日常生活及工作能力，大量動物及臨床研究[1-4]均證實刺激曲池穴及足三里穴可明顯改善腦卒中的運動功能，但其機制尚未完全闡明。分子生物學是近年來研究針刺作用機制的熱點，有資料顯示Notch信號通路在腦組織缺血時可被激活，從而調控缺血后神經的再生及修復過程，實現了神經保護效應，由此，針刺曲池穴及足三里穴改善腦卒中病情的機制是否通過Notch信號通路介導？我們建立了MCAO大鼠模型模擬臨床缺血性腦卒中，證實電針曲池穴及足三里穴確可明顯改善MCAO大鼠的神經行為學能力，我們亦進行一系列分子生物學技術檢測，以期探討其作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 36只清潔級SD大鼠均購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司，鼠齡10～12周，平均（11.23±0.24）周，體重220～280 g，平均（250.42±4.23）g。

1.1.2 主要試劑及儀器 10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司），液氮（凱福達化工有效公司），環球牌不銹鋼毫針（蘇州針灸用品有限公司）、2%TTC染色液（Solarbio公司）、Notch1一抗（CST公司）、Hes1一抗（CST公司）、-actin抗體（CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）分組：適應性飼養7 d后對36只大鼠進行隨機數字編號，造模后將造模大鼠隨機分為模型組及針刺組，各組均12只大鼠。3組大鼠在鼠齡、體重等方面差異無統計學意義（P>0.05），可進行比較。2）模型制備[5]：適應性飼養7 d后禁食不禁水12 h，稱重后使用10%水合氯醛以0.3 mL/kg比例對各組大鼠進行充分麻醉，參照Zea-Longa法進行MCAO模型制備，將大鼠固定于手術臺上于頸部正中處切開皮膚，左側頸總動脈充分暴露于術者視野中，使用顯微鑷逐步分離出頸內動脈及頸外動脈，并于頸內動脈及頸外動脈分叉口處對頸外動脈進行充分結扎，隨后用血管夾夾閉頸內動脈，在頸內動脈做一切口插入線栓，隨后取出血管夾至線栓插入約2.0 mm為度，隨后縫合皮膚?？瞻捉M大鼠僅進行皮膚切開及血管分離術后縫合皮膚。所有大鼠均注意保暖。

1.2.2 干預方法 造模次日對針刺組大鼠進行電針曲池穴及足三里穴，穴位定位參考李忠仁主編的《實驗針灸學》，針刺深度達到約6 mm時接入電針儀，選用疏密波，頻率2～10 Hz，以大鼠肢體輕微抖動為度，30 min/次，1次/d?？瞻捉M及模型組大鼠均僅接受模擬捉拿，1次/d。連續干預14 d后處死所有大鼠，并進行取材。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 神經行為學評分 對大鼠神經缺損癥狀進行評估，具體如下：大鼠未出現任何神經缺損癥狀視為0分;造模后大鼠出現右側肢體伸展不利視為1分;造模后大鼠行走時向右側轉圈視為2分;造模后大鼠行走時向右傾倒視為3分;造模后大鼠無法行走視為4分。

1.2.3.2 TTC染色 利用TTC染色法對各組大鼠腦梗死體積的測量，各組大鼠干預結束后處死取出腦組織，均勻切成厚度約2 mm的腦片，利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑進行染色，正常腦組織可與2，3，5-氯化三苯基四氮唑進行脫氫酶反應最終顯示鮮紅色，而梗死腦區域因無法進行脫氫酶反應或者反應減弱而呈現白色。利用Image-Pro Plus 6.0分析軟件對白色區域進行計算，得出腦梗死體積百分比（%）=（腦片白色區域面積總和×2 mm）/全腦片面積×2 mm×100%。

1.2.3.3 HE染色 于腹主動脈注入4%的多聚甲醛進行腦組織灌流固定，冰上取出腦組織后均勻分成4等份，分別置于70%、80%、95%、100%梯度乙醇液體中進行脫水，再用二甲苯透明，再用石蠟進行包埋，待蠟塊充分冷卻后切成厚度約5 μm薄片，固定于載玻片上備用。隨后將切片固定10～30 s，再用蘇木精-伊紅染色，采用光學顯微鏡對樣本進行讀取。

1.2.3.4 Western blot 充分麻醉后取出左側腦組織約100 mg，加入蛋白裂解液充分裂解后將樣本置于4 ℃、14 000 g/min條件下離心10 min，抽取上清液，利用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定并計算出各組上樣量。將上述總蛋白分裝于1.5 mL EP管中，在100 ℃水浴中煮沸變性5 min，充分冷卻后根據事先計算的上樣量加至SDS-PAGE凝膠孔道中，80 V恒壓電泳，再用PVDF膜轉膜目標蛋白，再用5%脫脂奶粉進行封閉2 h，再分別加入一抗（羊抗Notch1 1∶1 000，羊抗Hes1 1∶1 000，β-actin 1∶1 000），孵育過夜，隨后用TBST洗滌3次，5 min/次，再用HRP標記的二抗（1∶5 000）室溫反應2 h，加入ECL顯影液，反應60 s后于顯影儀器中進行條帶掃描，得出灰度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，所有數據運用均數±標準差（±s）表示，數據符合正態分布使用t檢驗，偏態分布采用秩和檢驗，檢驗標準為α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針曲池穴及足三里穴可降低MCAO大鼠神經行為學評分 接受造模的2組大鼠神經行為學評分均明顯升高，進行為期14 d干預后，針刺組大鼠神經行為學評分明顯提高，與模型組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經行為學評分比較（±s，分）

注：組內比較，*P<0.05;與模型組干預第14天比較，△P<0.05

2.2 電針曲池穴及足三里穴可縮小MCAO大鼠腦梗死體積 接受造模的2組大鼠腦組織可見明顯白色區域，進行為期14 d干預后，針刺組大鼠區域較模型組明顯縮小，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2、圖1。

表2 各組腦梗死體積比較（±s，%）

注：組內比較，*P<0.05，與模型組干預第14天比較，△P<0.05

圖1 各組大鼠腦片TTC染色結果

2.3 電針曲池穴及足三里穴可明顯改善MCAO大鼠腦組織結構及形態 空白組大鼠腦組織細胞排列整齊有序，細胞核完整。模型組大鼠腦片可見神經元細胞排列錯亂及皺縮，存在明顯壞死現象;針刺組大鼠腦組織部分神經元細胞結構尚可，排列較模型組整齊，部分神經元細胞出現濃染。見圖2。

圖2 各組MCAO大鼠腦組織結構及形態

2.4 電針曲池穴及足三里穴可明顯改善上調MCAO大鼠腦組織Notch1、Hes1蛋白濃度 使用Western blot法對各組大鼠腦組織Notch1、Hes1的蛋白水平進行檢測，結果發現MCAO術后模型組及針刺組大鼠Notch1、Hes1的蛋白表達均降低，與空白組比較差異有統計學意義（P<0.05）。經過14 d干預后針刺組大鼠Notch1、Hes1的蛋白水平有所上調，與模型組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠Western blot結果

3 討論

腦卒中屬于古籍中“中風”“痿證”等范疇，認為腦脈痹阻、腦髓失養使其主要病機，由此導致半身不遂等諸癥[6-8]。此病病位在頭部，《景岳全書》曰：“凡病此者……陰虧于前而陽損于后……以致陰陽相失，……卒然仆倒”，《靈樞·根結》亦記載：“太陽為開，陽明為合，少陽為樞……合折則氣所止息，而痿疾起矣。故痿疾者，取之陽明”，故調節陽明經是治療腦卒中的關鍵。曲池穴為手陽明大腸經合穴，足三里是足陽明胃經合穴，兩穴均是陽明經要穴，乃陽明經氣匯聚之所，故使用二穴治療腦卒中由來已久，正如《針灸逢源·中風門》中認為：“癱瘓，此由將息失宜，……猝倒無知也，曲池……足三里”，此外，亦有學者[9]總結近年來中西醫手段治療腦卒中的相關文獻后發現曲池穴及足三里穴是使用頻率最高的穴位，因此本研究選用曲池穴及足三里穴對MCAO大鼠進行干預具有理論可行性。在對各組大鼠神經行為學評分統計中我們發現經過MCAO造模后大鼠平很明顯升高，這提示MCAO術使大鼠產生了明顯神經缺損癥狀，經過針刺干預后大鼠神經行為學評分下降，提示針刺曲池穴及足三里穴可明顯改善大鼠神經缺損癥狀，與此同時我們還發現模型組及針刺組大鼠腦片TTC染色后出現明顯白色區域，這提示本研究造模是成功的，且經過針刺干預后大鼠腦梗死體積明顯縮小，這提示電針能夠減MCAO造模大鼠腦梗死體積，這一數據與國內外諸多文獻結果一致。

研究中我們還發現MCAO術后大鼠神經元細胞排列錯亂及皺縮，存在明顯壞死現象，經過針刺干預后大鼠腦組織神經元細胞結構及形態有明顯改善，這說明針刺曲池穴及足三里穴具有明顯的腦保護作用。在進一步研究中我們對各組大鼠腦組織Notch信號通路上的標志性蛋白Notch1、Hes1進行檢測，結果顯示MCAO術后模型組及針刺組大鼠Notch1、Hes1的蛋白表達均降低，與空白組比較差異有統計學意義（P<0.05）。經過14 d干預后針刺組大鼠Notch1、Hes1的蛋白水平有所上調，與模型組比較差異有統計學意義（P<0.05）。Notch信號通路在機體中扮演信號裝置的角色，相鄰的神經元細胞通過Notch受體與相應配體結合，從而產生自我更新效應，亦有學者[10]認為Notch信號通路是決定神經元細胞增殖或凋亡的關鍵。Notch受體與配體結合后釋放大量的活性物質，促進Notch 1因子出現核移位，與細胞核內的DNA相結合，由此激活其下游因子Hes家族，而Hes家族尤其是Hes1是調控神經干細胞增殖分化的重要因子，并可促進膠質生成而發揮神經元保護作用[11-15]，由此看來，針刺曲池穴及足三里穴發揮神經元保護效應的作用機制可能通過Notch信號通路進行介導。

本實驗發現針刺曲池穴及足三里穴可明顯改善MCAO大鼠神經缺損癥狀，通過激活Notch信號通路發揮腦保護作用，但本研究對MCAO大鼠進行為期14 d干預，大鼠具有極強的自愈能力，可能對本研究結果產生一定偏倚，下階段將進行更嚴格的實驗設計以期更為客觀研究針刺的作用機制。

參考文獻

[1]何華.缺血性中風后遺癥神經功能重建的可能機制[J].山東醫藥，2006，46（7）：81-82.

[2]Kim EH，Kim YJ，Lee HJ，et al.Acupuncture increases cell proliferation in dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils[J].Neurosci Lett，2001，297：21-24.

[3]Sato C.An experience note in attending Global Aging Initiative[J].Nihon Ronen Igakkai Zasshi，2013，50（5）：669-670.

[4]洪震.腦卒中的流行病學及其危險因素[J].中國卒中雜志，2006，1（8）：559-563.

[5]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84-91.

[6]游詠梅，薛偕華，陶靜，等.電針曲池穴及足三里穴對腦缺血再灌注損傷大鼠神經細胞線粒體凋亡途徑的影響[J].中華物理醫學與康復雜志，2014，36（10）：745-750.

[7]付彩紅，李匡時，鄒憶懷.針刺陽陵泉對中風偏癱患者感覺運動網絡影響的fMRI研究[J].天津中醫藥，2016，33（5）：260-264.

[8]楊娟.通督調神針刺法治療缺血性中風偏癱的臨床研究[D].廣州：廣州中醫藥大學，2011.

[9]勞沛良，江潔慈，原林.針刺治療腦卒中后遺癥取穴規律探究[J].吉林中醫藥，2011，31（4）：342-343.

[10]Shimada IS，Borders A，Aronshtam A，et al.Proliferating reactive astrocytes are regulated by Notch-1 in the peri-infarct area after stroke[J].Stroke，2011，42（11）：3231-3237.

[11]Shimada IS，LeComte MD，Granger JC，et al.Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke[J].J Neurosci，2012，32（23）：7926-7940.

[12]Woo SM，Kim J，Han HW，et al.Notch signaling is required for maintaining stem-cell features of neuroprogenitor cells derived from human embryonic stem cells[J].BMC Neurosci，2009，10：97.

[13]Borghese L，Dolezalova D，Opitz T，et al.Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo[J].Stem Cells，2010，28（5）：955-964.

[14]Liu J，Sato C，Cerletti M，et al.Notch signaling in the regulation of stem cell self-renewal and differentiation[J].Curr Top Dev Biol，2010，92：367-409.

[15]Zhou ZD，Kumari U，Xiao ZC，et al.Notch as a molecular switch in neural stem cells[J].IUBMB Life，2010，62（8）：618-623.