結直腸癌細胞通過IL-33/ST2軸招募肥大細胞的研究

馬孫強， 馬 成， 李濟宇

(1. 同濟大學附屬第十人民醫院普外科，上海 200072； 2. 安徽醫科大學上海臨床學院，上海 200072)

結直腸癌作為最常見的消化道惡性腫瘤之一，2012年全世界新增結直腸癌患者140萬，約70萬患者死于結直腸癌[1-2]。在我國，結直腸癌發病率逐年升高，在男性和女性中分別成為發病率居第3位和第2位的惡性腫瘤[3]。以往的研究[4-5]表明，結直腸癌組織中肥大細胞的數目較多，且與腫瘤的分期和預后有關。但是結直腸癌組織中肥大細胞數目增多的機制還不是很清楚，因此探索被募集至腫瘤組織的肥大細胞數目增多的機制對進一步理解結直腸癌的發生發展具有重要意義。Fang等[6]研究表明，結直腸癌組織中IL-33的表達增加。同時之前的研究[7-8]發現，骨髓來源肥大細胞(bone marrow-derived mast cell, BMMC)表面表達IL-33的受體ST2。由此，本研究旨在探討被募集至結直腸癌組織的肥大細胞是否是通過腫瘤組織高表達的IL-33作用于肥大細胞表面的ST2受體這一IL-33/ST2軸來實現的，以及是否被活化產生多種細胞因子，從而促進了結直腸癌的發展。

1 材料與方法

1.1 一般資料

15組結直腸癌及其相應的癌旁組織切片和患者信息由同濟大學附屬第十人民醫院病理科提供，已獲得患者的知情同意。以上病例均無其他惡性腫瘤病史，臨床資料和病理資料完整。

1.2 細胞及主要試劑

肥大細胞株HMC-1、LAD2和人結腸癌細胞株DLD-1、LoVo均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。Boyden遷移小室購自美國Costar公司(貨號： 3422)；TRIzol購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒(貨號： RR037A)、PCR試劑盒(貨號： AA4701A)購自日本TaKaRa公司；抗ST2抗體(貨號： ab25877)、抗IL-33抗體(貨號： ab54385)和sST2(貨號： ab219662)購自美國Abcam公司，TPSAB1抗體(貨號： 13343-1-AP)購自美國Proteintech公司。

1.3 方法

1.3.1 組織免疫熒光染色檢測腫瘤標本中肥大細胞以及IL-33的表達 每組腫瘤組和癌旁組內每張切片隨機截取3個200倍視野。盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA)，選取相同的綠色作為判斷所有照片陽性的統一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值(integral optical density, IOD)。

1.3.2 細胞免疫熒光檢測ST2的表達 用含有10%的胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養基將肥大細胞均勻鋪在共聚焦皿上，放入37℃、5%CO2細胞培養箱中，以備第2天使用。將前1天鋪有肥大細胞的共聚焦皿從細胞培養箱中取出，用PBS輕輕沖洗2次，經4%甲醛固定，BSA封閉，一抗二抗孵育后，滴加抗猝滅劑后熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 條件培養基(conditioned media)的制備 人結腸癌細胞株用含10%FBS的DMEM培養基培養，待正常培養的結腸癌細胞長滿培養皿，去除培養液，換成無血清DMEM培養基，培養48h，收集上清液離心過濾即得條件培養基。

1.3.4 Transwell細胞遷移實驗 實驗采用8μm孔徑24孔Boyden遷移小室，將3×104LAD2細胞重懸于200μL無血清RPMI 1640加入上室，下室分別加入500μL各實驗組別培養基(IL-33組、DLD-1-CM組和LoVo-CM組)。放入37℃恒溫細胞培養箱，14h后取出小室，通過固定，結晶紫染色，顯微鏡下拍照，計數并統計穿膜細胞數目。

1.3.5 細胞總RNA的提取以及RT-qPCR檢測 按照TRIzol試劑說明書提取細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒的操作步驟將總RNA反轉錄為cDNA,根據PCR試劑盒說明書進行RT-qPCR檢測，在ABI Prism 7500系統上進行擴增。以GAPDH為內參，采用相對定量法(2-ΔΔCt)進行定量分析。反應體系為20μL，擴增條件： 95℃ 5min變性，95℃ 30s,55℃ 30s，72℃ 30s，30個循環，72℃ 5min。所用引物序列見表1。

1.3.6 Western印跡法檢測 收集待檢測細胞，提取細胞蛋白。按照BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。100℃，10min高溫變性，加入6×蛋白上樣緩沖液。經過10% SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉膜，10%脫脂牛奶室溫封閉1h，一抗孵育過夜，TBST清洗5min，共6次，二抗37℃孵育1h，TBST清洗5min，共3次，然后暗室曝光顯影。

表1 引物序列Tab.1 Sequence for primers

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 結直腸癌組織中，肥大細胞數目和IL-33含量增加

研究[9]發現，分布在皮膚、腸黏膜的肥大細胞表達類胰蛋白酶(tryptase)，可以作為肥大細胞的標記蛋白。免疫熒光結果顯示，結直腸癌旁組織和癌組織的肥大細胞數量分別為(26.26±15.35)和(73.29±33.44)個，與癌旁組織相比，結直腸癌組織的肥大細胞數量明顯多于癌旁組織(P<0.001)，見圖1A、B；腫瘤組織中的IL-33含量顯著高于癌旁組織(P<0.001)，見圖1C、D。

圖1 組織免疫熒光檢測結腸癌組織和癌旁組織的肥大細胞數目和IL-33表達情況Fig.1 Immunofluorescence staining was performed to determine the number of MCs infiltrated in CRC or adjacent tissues and the expression of IL-33A： 免疫熒光檢測結直腸癌組織和癌旁組織的肥大細胞表達情況；B： 統計分析結直腸癌組織及癌旁組織肥大細胞數目；C： 免疫熒光檢測結直腸癌組織和癌旁組織的IL-33表達情況；D： 統計分析結直腸癌組織及癌旁組織IL-33的表達量；與癌旁組織相比，*P<0.001

2.2 肥大細胞表達IL-33的受體ST2

為了驗證結腸癌組織中浸潤的肥大細胞可能是通過IL-33/ST2軸被募集過來的，本研究通過細胞免疫熒光和Western印跡法檢測肥大細胞株HMC-1和LAD-2的ST2的表達情況。細胞免疫熒光顯示，ST2在胞膜和胞質中呈現綠色熒光，提示ST2表達于肥大細胞胞膜和胞質，見圖2A、B。Western印跡法結果顯示，HMC-1和LAD-2均表達ST2，見圖2C。

2.3 IL-33/ST2軸在肥大細胞招募中的作用

為了驗證IL-33在腫瘤組織招募肥大細胞的過程起作用，本次研究做了Transwell細胞遷移實驗。結果顯示，添加IL-33、DLD-1-CM和LoVo-CM的肥大細胞相比空白對照組遷移能力顯著增強(P<0.05)，而上述3組在添加IL-33抑制劑sST2后，肥大細胞的遷移能力又明顯減弱(P<0.01)，見圖3。上述結果提示加入IL-33抑制劑sST2后，肥大細胞的遷移能力相比對照組減弱，說明IL-33可能在腫瘤組織招募肥大細胞的過程中起著重要的作用，并且是通過IL-33/ST2軸來實現的。

圖2 細胞免疫熒光和Western印跡法檢測肥大細胞表面ST2的表達Fig.2 Immunofluorescence and Western blotting were performed to detect ST2 expression on mast cellsA： HMC-1細胞；B： LAD2細胞；C： Western 印跡法檢測

圖3 Transwell細胞遷移實驗檢測肥大細胞遷移能力的變化Fig.3 Transwell assay was performed in MCsA： 從左到右的下層小室培養基分別是： 無血清RPMI 1640，無血清RPMI 1640+IL-33(10ng/mL)，DLD-1-CM，LoVo-CM;B： 分別將A圖四組中加入IL-33抑制劑sST2(10ng/mL); C: 遷移能力比較；與NC組相比，*P<0.05，**P<0.01，與末加入sST2時相比，#P<0.05，##P<0.01

2.4 腫瘤細胞對招募的肥大細胞的影響

為了進一步研究肥大細胞在通過IL-33/ST2軸被募集至腫瘤組織后是否被活化，將肥大細胞與腫瘤細胞共培養，利用細胞的貼壁能力的差異將肥大細胞分離出后，分別于第0、2、4、8、12、24小時在mRNA水平檢測肥大細胞細胞因子IL-4、IL-6、IL-10和GM-CSF的表達。結果顯示，與對照組相比，與結腸癌細胞共培養后的肥大細胞表達IL-4、IL-6、IL-10和GM-CSF轉錄水平明顯增加，其中IL-4和GM-CSF轉錄水平在8h上升最顯著，IL-4是對照組的(13.71±1.57)倍(P=0.012)，GM-CSF是對照組的(6.46±1.25)倍(P<0.01)；IL-6在24h表達水平最高，是對照組的(4.55±0.06)倍(P<0.01)；IL-10在4h表達水平上升最顯著，是對照組的(6.44±0.65)倍(P<0.01)，見圖4。

圖4 與結腸癌細胞共培養的肥大細胞活化產生多種細胞因子Fig.4 Mast cells co-cultured with colon cancer cells activated to produce multiple cytokinesA： IL-4; B： IL-6; C： IL-10; D： GM-CSF；與NC組相比，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

結直腸癌腫瘤微環境免疫細胞與腫瘤發生發展密切相關，也被認為是其免疫治療成敗的關鍵[10]。本研究發現，結直腸癌在發生發展過程中能夠大量表達IL-33，并能夠通過該途徑募集肥大細胞至腫瘤組織中。肥大細胞作為組織駐留的崗哨細胞，廣泛存在于與外界相通的結直腸中。本次研究進一步發現，肥大細胞與CRC細胞共培養后，MC表達IL-4、IL-6、IL-10和GM-CSF等多種與其生長相關的細胞因子，這為肥大細胞在腫瘤進展過程中發揮其免疫學作用提供了重要的支撐。

肥大細胞起源于CD34+、CD13+、c-kit+的造血干細胞，并遷移到周圍組織中完成其分化成熟過程，此后依據特定免疫刺激而發揮相應功能[11]。近年研究[12]發現，肥大細胞并不僅僅局限于在抗寄生蟲和過敏反應中的主導作用，其與腫瘤關系也日益受到重視[9,12-14]。腫瘤浸潤骨髓細胞在腫瘤的生長中發揮積極作用，肥大細胞是一個最早的浸潤腫瘤的細胞類型[15]。肥大細胞通常積聚在正常組織和惡性腫瘤的連接區,在腫瘤微環境血管生成,細胞毒性作用介導以及組織重塑中均發揮重要作用[16]。本實驗通過利用15組結直腸癌及其相應的癌旁組織標本,證實肥大細胞在腫瘤組織中廣泛浸潤。既往研究中,Strouch等[9]通過對53組人胰腺癌組織及其相應的癌旁組織標本進行免疫組織化學染色發現，胰腺癌組織中的肥大細胞數目顯著高于鄰近癌旁組織，并且肥大細胞的浸潤與患者的不良預后存在著關聯；Melillo等[13]對96例甲狀腺癌組織和14例正常甲狀腺組織進行免疫組織化學染色發現，肥大細胞僅存在于癌組織中，13例正常甲狀腺組織中僅有1例少量浸潤，并且高表達肥大細胞的甲狀腺癌患者發生腫瘤遠處轉移的風險較高。這些均和本次研究結果一致,然而肥大細胞是如何浸潤于腫瘤組織中還有待進一步明確。

發展中的腫瘤細胞可以釋放出多種促進免疫細胞募集的細胞因子[17]，而IL-33是一種多功能細胞因子,在介導2型輔助性T細胞(helper T cell 2, Th2) 型和固有淋巴細胞2(innate lymphoid cell 2, ILC2)免疫反應中發揮關鍵作用[18]。本研究發現IL-33同樣在結直腸癌腫瘤組織中高表達，且與肥大細胞的分布和豐度高度一致。肥大細胞作為介導Th2型免疫反應的重要細胞類型，并高表達IL-33的受體ST2,通過體外細胞遷移實驗發現，以添加IL-33為陽性對照組，在含DLD-1-CM和LoVo-CM的肥大細胞中,相比空白對照組其遷移能力顯著增強，提示結腸癌細胞可通過產生特定細胞因子促進肥大細胞遷移；進一步加入IL-33受體抑制劑sST2后，肥大細胞的遷移能力有顯著下降，證明結腸癌細胞產生的IL-33在肥大細胞遷移中起著重要的作用。值得一提的是,之前有研究[19]表明，IL-33在介導中性粒細胞遷移進而加重類風濕關節炎中同樣發揮重要作用。Fang等[6]也證實IL-33通過招募巨噬細胞促進結直腸癌細胞干細胞干性的表達。

IL-33/ST2軸不僅能夠觸發Th2型免疫,研究表明它還能通過上調抗凋亡分子(B-cell lymphoma-X large, BCLXL)維持人皮膚來源和小鼠骨髓來源肥大細胞的生長[20]。本研究將肥大細胞與結腸癌細胞共培養發現，共培養后的肥大細胞中IL-4、IL-6、IL-10和GM-CSF轉錄水平明顯增加,這些細胞因子可以促進肥大細胞的生存生長[8,21-22]。

綜上，本研究證明了結直腸癌組織通過產生IL-33作用于肥大細胞表面的ST2受體將其募集至腫瘤部位，為結直腸癌中肥大細胞的浸潤機制提供了重要的思路，為完善結直腸癌的治療提供了新的理論基礎。