攜白細胞介素-8單克隆抗體的靶向對比劑對兔心肌梗死微循環的定量研究

張曉奇，張容亮，孫月，陸永萍

昆明醫科大學第四附屬醫院，云南省第二人民醫院超聲科，云南昆明 650021；

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后對心肌微循環的評估可預測患者預后，心肌聲學造影（myocardial contrast echocardiography，MCE）采用的對比劑微泡與紅細胞有相似的流變能力，可用于評估心肌微血管灌注的程度[1]。炎癥反應參與心肌梗死的整個過程。AMI后，心肌缺血及壞死部位會釋放多種炎性細胞因子，白細胞介素（interleukin，IL）是參與其中的重要細胞因子之一[2]，其中 IL-8具有促進炎癥反應、刺激血管生成等作用[3]。本研究采用SonoVue對比劑耦聯IL-8單抗后形成靶向對比劑，對心肌梗死兔模型行 MCE檢查，對比單純使用SonoVue對比劑，對兔心肌梗死后心肌微循環灌注進行定量分析，評價攜 IL-8單抗對比劑的特異性靶向功能，使MCG能夠更準確、更早期地診斷缺血性心臟病，為定量分析、評估心肌灌注提供一種無創且更加精準的方法。

1 材料與方法

1.1 制備動物模型 選取健康成年日本大耳白兔30只[由昆明醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證SCXK（滇）2011-0004]，體重2.7～3.5 kg，雌雄不限，體健毛光。采用簡單隨機抽樣法，將30只兔排號，通過抽簽的方式隨機分為AMI組和假手術組，每組15只。AMI組：結扎冠狀動脈左前降支制作左心室前壁、前間隔心肌梗死模型；假手術組：同一結扎點只穿線不結扎，其他操作均與AMI組相同。具體操作見既往研究[4]。

1.2 制備攜IL-8單抗的靶向對比劑 采用共價耦聯法通過SPDP交聯劑將IL-8單抗耦聯于SonoVue微泡表面，制備靶向超聲對比劑[5]。

1.3 對動物模型行常規心臟超聲檢查及 MCE檢查采用Philips iE33型超聲診斷儀，心臟探頭型號S5-1，頻率為1.8/3.6 MHz。將各組兔分別于術前、術后30 min、2 h及6 h行常規心臟超聲檢查、SonoVue對比劑及攜IL-8單克隆抗體靶向對比劑MCE檢查。各組兔每次完成常規心臟超聲檢查后，啟動造影程序，每次抽取0.15 ml SonoVue對比劑，經兔耳緣靜脈團注，然后立即使用1 ml生理鹽水沖注，重點觀察造影時左心室短軸乳頭肌水平各節段心肌的超聲圖像變化，記錄開始顯影時間，待心肌顯影穩定后，通過觸發高能量脈沖（Flash閃爍）對心肌組織內的對比劑進行破泡，觀察儀器自動轉換成低能量實時造影過程中對比劑再充盈情況，儲存檢查過程中的全部動靜態圖像，應用QLAB 8.0軟件，在左心室乳頭肌水平短軸切面上選取前間隔、前壁、下壁和后間隔 4個節段作為主要分析節段（因對比劑微泡進入左心腔后，側壁及后壁受到聲衰減影響，故而不列入研究節段），對充盈影像進行脫機分析，分析過程中，所有的實驗動物命名只用編號，不標明分組。設定感興趣區域后，以Flash后第一幀為起點，繪制感興趣區域心肌對比劑灌注的時間-強度曲線（time-intensity curve，TIC）。軟件可計算出感興趣區域的超聲均值、超聲峰值、達峰時間、超聲中值等，本實驗選取超聲均值、達峰時間、開始顯影時間作為研究指標。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件，正態分布的計量資料以±s表示。同一樣本進行2次不同處理，用配對t檢驗；2個不同樣本進行相同處理，用獨立樣本t檢驗。多個樣本比較采用方差分析。等級資料用秩和檢驗進行分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型制備情況 30只模型兔在實驗過程中，假手術組死亡2只，其中1只在開胸后立即死亡，原因可能是麻醉過量引起呼吸衰竭、死亡；另1只術中因胸膜破裂致呼吸衰竭死亡；AMI組死亡5只，其中2只為術中胸膜破裂致呼吸衰竭死亡，另外3只分別于結扎冠狀動脈后約15 min、1 h及3 h后死亡，可能與手術操作不當、麻醉不當、心肌梗死面積過大、動物模型本身等因素有關。

2.2 QLAB定量分析 以開始注射對比劑為起點，2種對比劑 AMI組各節段心肌對比劑視頻強度的超聲均值見表1。

表1 AMI組各節段心肌對比劑視頻強度的超聲均值比較（ ±s，dB）

表1 AMI組各節段心肌對比劑視頻強度的超聲均值比較（ ±s，dB）

注：與術前比較，*P<0.05；與下壁比較，#P<0.05；與后間隔比較，&P<0.05

術后 2 h（n=11） SonoVue 4.91±0.95*# 4.96±1.05*& 14.87±1.44 15.02±1.87 IL-8靶向8.78±1.30*#8.99±0.99*&18.26±2.37*18.49±2.31*術后6 h（n=10）SonoVue 5.09±1.25*#5.20±1.11*&15.46±1.7815.03±1.83 IL-8靶向9.52±1.13*#9.32±1.39*&18.45±2.23*18.65±2.14*

各節段心肌超聲均值比較：術后30 min、2 h及6 h，AMI組兩造模節段（前壁及前間隔）的對比劑超聲均值低于術前，差異有統計學意義（P<0.05）；前壁與下壁之間比較，術后30 min、2 h及6 h，前壁的對比劑超聲均值低于下壁，差異有統計學意義（P<0.05）；前間隔與后間隔之間比較，術后30 min、2 h及6 h，前間隔的對比劑超聲均值低于后間隔，差異有統計學意義（P<0.05）。

對比SonoVue對比劑及攜IL-8單抗靶向對比劑：術前兩者前壁、前間隔、后間隔、下壁的對比劑超聲均值比較，差異無統計學意義（P>0.05）；而術后30 min、2 h及6 h，攜IL-8單抗靶向對比劑兩造模節段（前壁及前間隔）的對比劑超聲均值均高于SonoVue對比劑，差異有統計學意義（P<0.05）。同時，在術后30 min、2 h及6 h，后間隔、下壁的攜IL-8單抗靶向對比劑超聲均值高于術前，差異有統計學意義（P<0.05），而SonoVue對比劑術前、術后超聲均值比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

以開始注射對比劑為起點，假手術組2種對比劑前壁和前間隔心肌對比劑視頻強度的超聲均值見表2。術后30 min、2 h及6 h，AMI組前壁及前間隔的對比劑超聲均值均低于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）。

表2 假手術組兔造模節段心肌對比劑視頻強度的超聲均值比較（ ±s，dB）

表2 假手術組兔造模節段心肌對比劑視頻強度的超聲均值比較（ ±s，dB）

節段對比劑術前術后30 min 術后2 h 術后6 h前壁SonoVue 14.54±1.6814.54±1.7014.66±1.9014.49±1.61 IL-8靶向15.08±1.7814.61±1.5214.34±1.7614.48±2.04前間隔SonoVue 15.02±1.5914.64±1.9414.47±2.0514.57±1.98 IL-8靶向14.93±1.9014.43±1.9914.97±1.9414.47±1.68

2.3 AMI組造模節段2種對比劑達峰時間和開始顯影時間比較 以Flash第一幀為起點，對AMI組造模節段對比劑達峰時間比較，術后30 min、2 h及6 h，IL-8單抗靶向對比劑AMI組2個造模節段（前壁及前間隔）的靶向對比劑達峰時間早于 SonoVue對比劑，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

表3 2種對比劑、AMI組造模節段對比劑的達峰時間比較（±s，s）

表3 2種對比劑、AMI組造模節段對比劑的達峰時間比較（±s，s）

注：與SonoVue對比劑比較，*P<0.05

對比劑節段對比劑達峰時間術前術后30 min 術后2 h 術后6 h SonoVue 前壁0.62±0.100.96±0.110.95±0.080.93±0.10前間隔 0.63±0.11 0.94±0.10 0.95±0.09 0.92±0.09 IL-8靶向前壁0.67±0.100.44±0.09*0.45±0.10*0.45±0.09*前間隔0.68±0.100.45±0.10*0.45±0.09*0.46±0.09*

以開始注射對比劑為起點，對AMI組造模節段心肌開始顯影時間比較，術后30 min、2 h及6 h，AMI組2個造模節段（前壁及前間隔）的攜IL-8單抗靶向對比劑開始顯影時間明顯早于 SonoVue對比劑，差異有統計學意義（P<0.05），見表4及圖1～4。

表4 2種對比劑、AMI組造模節段對比劑開始顯影時間比較（±s，s）

表4 2種對比劑、AMI組造模節段對比劑開始顯影時間比較（±s，s）

注：與SonoVue對比劑比較，*P<0.05

對比劑節段對比劑開始顯影時間術前術后30 min 術后2 h 術后6 h SonoVue 前壁12.65±0.5215.87±0.7915.37±0.7215.01±0.52前間隔 12.66±0.67 16.10±0.75 15.39±0.80 15.21±0.56 IL-8靶向前壁16.89±0.9711.03±0.67*11.31±0.70*11.56±0.65*前間隔16.79±0.9911.07±0.78*11.19±0.72*11.61±0.67*

圖1 攜IL-8單抗靶向對比劑假手術組和AMI組心肌各節段對比劑充盈的時間-強度曲線（TIC）。假手術組前壁、前間隔、后間隔及下壁4個不同節段的曲線走行及水平相近，AMI組前壁、前間隔2個節段的曲線水平明顯低于后間隔和下壁

圖2 SonoVue對比劑：假手術組術后30 min心肌顯影過程

圖3 SonoVue對比劑：AMI組術后30 min心肌顯影過程

圖4 術后30 min假手術組、AMI組攜IL-8單抗靶向對比劑（A為假手術組，B為AMI組）及SonoVue對比劑（C為假手術組，D為AMI組）充盈初期，AMI組攜IL-8單抗靶向對比劑即可見對比劑充盈，其余未見明顯對比劑充盈

3 討論

近年來，超聲靶向微泡造影技術逐漸成熟，已成為國內外超聲診斷、治療研究的熱點。既往MCE檢查中，SonoVue是較為常用的對比劑，而在AMI過程中常伴隨組織壞死和炎癥細胞浸潤。IL-8是一種具有強血管生成特性的炎性趨化因子[6]，在心肌梗死缺血壞死部位高表達，通過在普通超聲微泡表面裝配具有炎癥靶向性的特異配體（IL-8單抗），可構建成能與急性心肌梗死炎癥細胞浸潤區域靶向結合的靶向性超聲微泡，對該區域有更好的顯像效果。

心肌微循環灌注在AMI期間有非常重要的意義。普通的冠狀動脈造影往往針對的是冠狀動脈形態學檢查，僅限于直徑＞100 μm的冠狀動脈，而MCE能夠有效顯示直徑＜100 μm的微血管，可評估心肌血流灌注情況[7]。本實驗使用SonoVue對比劑及攜IL-8單抗的靶向對比劑行MCE時，對于同一實驗兔，AMI組2個造模節段（前壁及前間隔）的對比劑超聲均值均低于術前、非梗死區、假手術組，證實MCE定量評價心肌梗死區域的可靠性。AMI組在術后30 min、2 h及6 h，后間隔、下壁的攜IL-8單抗靶向對比劑超聲均值高于術前（P<0.05），而SonoVue對比劑則沒有這種現象。這是由于 AMI激活心肌內皮細胞和白細胞炎癥反應，可能會導致全身性的炎癥變化[8]，后間隔及下壁同樣會有的炎性因子浸潤，因此會表現出顯影較術前更明顯的現象，是攜 IL-8單抗靶向對比劑與炎性因子IL-8之間存在靶向性的又一證明。

同時，AMI組2個造模節段（前壁及前間隔）的攜IL-8單抗靶向對比劑超聲均值均高于SonoVue對比劑，且攜IL-8單抗對比劑的顯影時間和達峰時間均早于SonoVue對比劑，反映了IL-8單克隆抗體與缺血心肌釋放的炎性因子IL-8之間的靶向性，攜IL-8單抗靶向對比劑可以特異地集聚于缺血心肌內，與炎性因子結合、顯影，其顯影效果和速度優于普通SonoVue對比劑。兔在冠狀動脈結扎術后造模節段的微循環會顯著減少，而側支循環的建立需要時間，MCE結果本應表現為充盈較差甚至充盈缺損，但實驗過程中，AMI組術后應用攜IL-8單抗靶向對比劑30 min即表現出造模節段對比劑充盈明顯強于SonoVue對比劑，充盈速度快于SonoVue對比劑。因此，在AMI早期（術后30 min），造模節段的炎性因子IL-8明顯升高。因此，心肌缺血可行攜帶 IL-8單抗的靶向對比劑 MCE檢查，其效果優于普通SonoVue對比劑MCE檢查，在識別梗死區域方面有較大優勢，為診斷缺血性心臟病提供了一種更早期、更精準的方法。

本研究的局限性為：首先，由于所用超聲儀器使用了成人心臟超聲探頭，型號為S5-1，頻率過低（頻率僅1.8/3.6 MHz），觀察兔心臟的分辨率相對較差，圖像質量較低，會影響研究圖像的精確性；這個可通過將來研究中更換更高頻率的心臟超聲探頭進行改善。其次，本研究由于對比劑微泡進入左心腔后，側壁及后壁受到聲衰減影響，僅能觀察前間隔、左心室前壁、下壁、后間隔，無法觀察左心室側壁、后壁。因此觀察不夠全面，這也是超聲二維成像本身的局限性，鄭智超等[7]的研究顯示，與普通的二維 MCE檢查相比，聲學造影RT-3DE成像可以更立體、更全面地對各室壁顯像，此方法可以在后續研究中加以運用。靶向對比劑攜帶的 IL-8單抗可與心肌缺血區域的IL-8特異性結合、顯影，其對心肌微循環灌注研究具有獨特的優勢，攜IL-8單抗靶向對比劑MCE檢查可對缺血性心臟病提供更早、更精確的診斷方法，是目前較為理想的方法。此外，攜IL-8單抗靶向對比劑對缺血心肌部位 IL-8的靶向性為今后心肌缺血早期從細胞及分子水平進行診斷、治療提供了新的思路，隨著分子影像學的發展，本課題組也將對超聲微泡的靶向治療進行更深層次的研究。