撈刀河瀏陽段河蜆的遺傳多樣性及生殖特征研究

王劍平 李德亮, 曾 聰, 朱鵬飛 占江凡

(1. 湖南農業大學, 湖南省特色水產資源利用工程技術研究中心, 長沙 410128;2. 水產高效健康生產湖南省協同創新中心, 常德 415000)

河蜆Corbicula fluminea原產于亞洲、非洲、澳洲和中東地區, 后擴散到北美、南美和歐洲, 成為世界知名的入侵種, 且對入侵地的經濟和生態分別造成嚴重的危害[1]。我國是河蜆重要的原產區,河蜆因其豐富的營養價值和藥用價值歷來深受我國東南沿海民眾的喜愛, 且是重要的漁業對象之一[2,3]。據記載[4]蜆肉具有開胃、明目、止咳、化痰和解酒等功效, 是重要的中藥材。此外, 河蜆還是人類重要的副食品, 也是畜禽類和魚類的天然餌料[5,6]。近年來, 隨著采捕強度的增加, 天然河蜆資源衰退趨勢劇增[7,8], 故其資源狀況與遺傳多樣性評價也逐漸受到重視, 以期為其資源的合理開發和有效保護提供參考。已有的研究分別采用微衛星、細胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)和細胞色素b(Cytb)分子標記分析了洪澤湖河蜆的遺傳多樣性和群體遺傳結構, 證實洪澤湖河蜆種群具有較高的遺傳多樣性水平, 種質資源較為豐富, 且不同湖區河蜆群體間沒有形成顯著的遺傳結構, 遺傳分化較低[9—11]。

大量研究[12]證實, 河蜆存在有性生殖和無性生殖兩種生殖方式, 無性生殖即專性雄核生殖。北美、南美和歐洲等入侵地的蜆均營專性雄核生殖,而原產地的蜆則兩種生殖方式并存。雌雄同體和雙鞭毛精子被認為是雄核生殖方式的典型特征[13]。目前, 我國學者先后對淀山湖[14]、遼寧大洋河[15]、黃河三角洲[16]和洪澤湖[17]河蜆的生殖特征進行研究, 證實河蜆為雌雄異體[16]或以雌雄異體為主, 存在少量雌雄同體個體[14,15,17]。張健[18]發現大通湖河蜆以雌雄同體個體為主, 雌雄同體、雄性和雌性的比例為25∶1∶11。盡管如此, 國內有關河蜆精子形態特征(尤其是雙鞭毛精子)的相關報道較少。

撈刀河是湘江的一級支流河, 發源于瀏陽市石柱峰北麓, 流經瀏陽市、長沙縣和長沙市區, 最終于長沙市開福區匯入湘江, 全長共141 km, 流域面積2543 km2, 為長沙市第二大內河, 河中擁有較為豐富的河蜆資源。本研究以線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ (COⅠ)部分序列為分子標記, 對撈刀河瀏陽段河蜆的種群遺傳多樣性進行評價, 并分別從性腺組織學和精子形態學方面分析其生殖特征, 以期豐富河蜆的繁殖生物學信息, 并為開展其人工繁殖及資源保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

河蜆樣品采自撈刀河瀏陽段(烏龍漁場: 113.429°E,28.289°N), 共計40個, 殼長21.60—31.79 mm; 殼寬12.20—17.25 mm; 殼高18.33—25.86 mm。

1.2 DNA提取

采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Marine Animals DNA Kit)提取新鮮河蜆外套膜DNA后, 使用核酸蛋白儀(Eppendorf, 德國)測定DNA的OD值, 確定DNA濃度, 再用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量, 剩余樣品DNA于–20℃保存備用。

1.3 PCR擴增與測序

線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)序列擴增的通用引物為LCO 1490 (5′-GGTCAACAAATCA TAAAGATATTGG-3′)和HCO 2198 (5′-TAAAC TTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)[19], 由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。PCR反應體系為25 μL, 包括: DNA模板1 μL (100 ng/μL), 2.5 μL的10×TaqBuffer, 上下游引物LCO 1490、HCO 2198各(10 μmoL/L) 1 μL, 2 μL的dNTP,TaqDNA聚合酶0.2 μL及17.3 μL的ddH2O。PCR反應條件程序為94℃預變性5min, 94℃變性1min, 52℃退火45s,72℃延伸1min, 共35個循環, 最后72℃延伸5min。取5 μL擴增產物進行1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測, 在凝膠成像系統下確定PCR產物為目的條帶后, 用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANgel Midi Purification Kit)純化目標產物, 并及時送于武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序。

1.4 精子形態分析

解剖并剪取上述已去除外套膜的河蜆性腺, 蒸餾水沖洗, 輕擠壓出精液, 蒸餾水稀釋精液, 稀釋后的精液與伊紅染液等體積混合, 涂片鏡檢。將擠壓后的性腺置于酒精醋酸福爾馬林混合固定液中保存, 備做組織學分析。

1.5 組織學分析

取酒精醋酸福爾馬林混合固定液保存的性腺標本, 經酒精脫水、二甲苯透明及透蠟, 于石蠟包埋和切片, HE染色后封片, 鏡檢。

1.6 數據處理與分析

測序所得序列分別與GenBank[20]中其他蜆屬貝類線粒體COⅠ基因序列比對后, 使用Geneious R11 軟件[21]對其進行編輯、排序和手動校對。序列的多重比對采用MEGA 6.0軟件[22]中的Clustal W軟件包[23]進行, 并計算序列堿基組成、變異位點數等。利用DnaSP 5.0軟件[24]分析樣品線粒體COⅠ基因序列的單倍型, 并計算種群的單倍型多樣性(h)、核苷酸多樣性(π)和平均核苷酸差異數(k)。

2 結果

2.1 種群遺傳多樣性

經過對撈刀河瀏陽段河蜆線粒體COⅠ基因序列排序、校對和剪輯, 獲得614 bp的基因序列, 其中, A、T、C和G四種堿基平均含量分別為22.70%、41.60%、14.50%和21.20%, A+T的含量(64.30%)明顯高于C+G的含量(35.70%)。40條COⅠ序列檢出17個變異位點, 約占基因序列的2.76%, 定義4種單倍型(圖1), 分別為hap1 (Gen-Bank登錄號為KT893373, 下同)、hap2 (MG595699)、hap3 (MG595700)和hap4 (KT893357)。該河段河蜆種群的平均單倍型多樣性為0.664±0.042, 平均核苷酸多樣性為0.014±0.006, 平均核苷酸差異數為8.595。

2.2 性腺組織學特征

撈刀河瀏陽段40個河蜆中, 存在雌雄同體個體27個(占67.50%) (圖2c-f)、雄性(圖2a)個體10個(占25.00%)和雌性(圖2b)個體3個(占7.50%), 三者的比例約為6∶3∶1。在對雌雄同體個體的性腺切片觀察中發現存在雌性生殖細胞的濾泡數量明顯多于雄性生殖細胞濾泡數量(圖2c)或雄性生殖細胞的濾泡數量明顯多于雌性生殖濾泡(圖2d)數量的現象。此外, 其濾泡存在2種類型: 濾泡并存型即精卵細胞分布于不同的濾泡中(圖2e); 濾泡混合型即精卵細胞分布于同一濾泡中(圖2f)。

2.3 精子形態特征

在34個進行精子形態分析的河蜆中, 雌雄同體個體23個, 雄性8個, 雌性3個。其中, 雌雄同體和雄性個體精子均具有雙鞭毛(圖3)。

3 討論

3.1 種群遺傳多樣性

圖1 撈刀河瀏陽段河蜆線粒體COⅠ部分序列4個單倍型與可變位點Fig. 1 Detection of 4 haplotypes and 17 variable sites in partial mitochondrial COⅠ sequences of Corbicula fluminea from the Laodao River in Liuyang city

圖2 撈刀河瀏陽段河蜆性腺組織學顯微結構圖(a. 雄性; b. 雌性; c—f. 雌雄同體)Fig. 2 Photomicrographs of sections of the gonads of Corbicula fluminea from the Laodao River in Liuyang city (a. male; b. female; c—f.hermaphrodites)

撈刀河40個河蜆COⅠ基因序列(614 bp)中,A、T、C和G四種堿基平均含量分別為22.70%、41.60%、14.50%和21.20%, A+T的含量(64.30%)高于C+G的含量(35.70%)。洪澤湖[10]河蜆線粒體COⅠ序列中A+T含量(65.00%)也高于C+G含量(35.00%)。因此, 本研究結果再次證明線粒體DNA序列堿基組成的不均一性, 具有很強的偏倚性[25]。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量物種遺傳多樣性的兩個重要指標[26]。Grant等[27]根據線粒體DNA序列的遺傳變異, 將不同單倍型多樣性指數(h)和核苷酸多樣性指數(π)間的組合分成4 種類型: 低h(＜0.5)與低π(＜0.005); 高h(＞0.5)與低π(＜0.005); 低h(＜0.5)與高π(＞0.005); 高h(＞0.5)與高π(＞0.005)。本研究中40個河蜆共檢出4 種單倍型和17個變異位點, 平均單倍型多樣性指數(h)為0.664,平均核苷酸多樣性指數(π)為0.014, 符合高h與高π類型。盡管如此, 本研究的結果均低于以COⅠ為分子標記(614 bp)所計算的洪澤湖[10,11]河蜆種群的結果。李大命等[10,11]分別在50個和77個洪澤湖河蜆中發現單倍型15個和22個, 核苷酸變異位點67個和73個, 平均單倍型多樣性指數0.870 和0.889, 平均核苷酸多樣性指數0.045 和0.04499。這種差異或許是由于2個區域河蜆的性別系統和生殖方式不同所造成的。瀏陽河河蜆以雌雄同體為主, 而洪澤湖河蜆一般雌雄異體, 偶見少量雌雄同體[17]。大量研究[12]證實, 雌雄同體河蜆可以通過自體受精或者異體受精(雌雄同體個體之間或雄性與雌雄同體個體之間)方式來完成生殖, 而自體受精則必然導致種群遺傳多樣性降低[13]。因此, 推測雌雄同體個體的自體受精或許是造成撈刀河瀏陽段河蜆種群遺傳多樣性相對較低的主要原因之一。盡管如此, 該推論還有待于更進一步地分析和證實。

圖3 撈刀河瀏陽段河蜆的精子形態Fig. 3 Sperm morphology of Corbicula fluminea from the Laodao River in Liuyang city

3.2 種群生殖特征

本研究中撈刀河瀏陽段河蜆存在雌雄同體、雄性和雌性個體, 三者比例約為6∶3∶1, 其中雌雄同體個體占半數以上, 雌性個體最少。該研究結果與張健等[18]對湖南大通湖河蜆性別特征分析的結果相似, 同時也表明撈刀河瀏陽段河蜆種群存在雌雄同體和雌雄異體兩種性別系統。但研究發現鄱陽湖[28]和黃河三角洲[16]的河蜆均為雌雄異體, 且性別比為1∶1。此外, 淀山湖[14]、遼寧大洋河[15]和洪澤湖[17]的河蜆也均以雌雄異體為主, 但存在少量雌雄同體個體?？梢姾油樀男詣e系統在不同水域具有較大的差異。某些學者[13,29]提出河蜆的性別機制與其棲息環境有關, 不同地區性別表現不同, 并且無法從外形上區分性別。文獻報道[14]軟體動物的雌性生殖細胞的分化是自動分化, 而雄性生殖細胞分化是由雄性激素等因子所調控的, 推測河蜆雌雄同體個體的出現可能與該類因子的影響有關。盡管如此, 河蜆多樣化的性別機制還有待于進一步深入分析研究。本研究中河蜆雌雄同體個體的生殖濾泡存在兩種類型: 一是濾泡混合型, 即精卵細胞分布于同一濾泡中; 二是濾泡并存型, 即精卵細胞分布于不同的濾泡中, 并存于性腺中的不同區域。該2種生殖濾泡分布方式與畢婷婷[17]在洪澤湖河蜆和張健[18]在大通湖河蜆中的研究結果相似。

本研究結果顯示, 撈刀河瀏陽段雌雄同體和雄性河蜆的精子均為雙鞭毛。類似的結果在日本也有報道, 志賀縣栗東市野洲河Corbicula leana雄性個體的精子均具有雙鞭毛, 并推測該雄性個體可能源自同種的雌雄同體個體[26]。Pignuer等[13]研究證實, 雌雄同體和雙鞭毛精子是雄核生殖方式的典型特征。故推測撈刀河瀏陽段河蜆主要的生殖方式為雄核生殖, 其次是有性生殖。雄核生殖過程是指精子和卵子受精后, 合子在發育過程中卵原核以兩個極體的方式被完全排出, 而合子的細胞核僅僅由精子原核發育而成[30—32]。因具有該生殖方式河蜆產生的精子均是未減數的, 即DNA含量與父本一致, 而非正常兩性生殖中精子染色體數目和DNA含量均為父本的一半, 故雄核生殖后代完全是父本的克隆[26]。盡管雄核生殖后代的細胞核來源于父本,但線粒體基因組則完全來源于母本。由于營雄核生殖的河蜆一般都是雌雄同體, 且主要通過自交或同種雜交的方式繁殖, 故后代細胞質和細胞核基因組來源不同往往沒有較大的特殊意義, 而當雜交發生在不同蜆屬種類之間時, 就會造成后代細胞質基因組信息與細胞核基因組信息的錯配[26]。因此, 撈刀河瀏陽段河蜆的專性雄核生殖特征及其在種群進化進程中的生物學意義還有待進一步深入分析研究。