發酵豆粕對大黃魚生長、腸道結構及腸道微生物菌群的研究

何嬌嬌 王 萍, 馮 建 婁宇棟

(1. 浙江海洋大學，浙江省海洋養殖裝備與工程技術重點室，舟山 316000; 2. 寧波大學海洋學院，寧波 315211)

大黃魚(Larimichthys Crocea), 俗稱黃花魚。自1985年以來, 我國大黃魚養殖業取得了很大的成就,但由于鮮雜魚餌的病原性及進口魚粉高昂的價格,顯著影響了大黃魚養殖業的發展[1]。因此, 基于當今魚類營養飼料研究的發展趨勢, 開發新型蛋白源用以滿足不同養殖魚類生長的需求是目前水產養殖飼料工業發展的必然[2]。近年來, 不乏學者用植物蛋白源對魚粉進行了替代研究, 研究結果表明,植物蛋白源的可替代性與實驗對象及實驗設計相關[3]。本文以抗原含量較低且蛋白質優質的發酵豆粕為主要植物蛋白源。研究表明, 發酵豆粕中有大量的益生素、乳酸及未知生長因子等物質[4]。對石斑魚(Epinephelus coioides)[5]、南美白對蝦(Penaeus vannameiBoone)[6]、方正鯽(Carassius auratus)[7]的研究證實: 發酵豆粕在水產動物飼料利用上有較好效果。

腸道是集消化、吸收、代謝、免疫、內分泌于一體的特殊的“微生物搖籃”, 菌群數量眾多, 各菌種之間互相制約, 互相依存, 達成一種生態平衡[8]。研究表明, 魚類腸道菌群隨魚類的生長和餌料的改變而發生改變[9]。如鐘蕾等[10]通過傳統方法PCRDGGE分析了人工配合飼料和冰鮮魚2種不同的餌料對鳡(Elopichthys bambusa)腸道菌群的影響。此前, 不少學者基于傳統方法進行了腸道菌群的研究,如周志剛等[11]運用PCR-DGGE指紋圖譜對川紋笛鯛(Lutjanus sebae)和圓白鯧(Ephippus orbis)消化道壁的優勢菌群結構進行了比較分析; 李學梅等[12]運用PCR-DGGE技術研究了3種室內飼養魚類腸道微生物群落。然而隨著微生物領域的發展, 高通量技術突破了傳統的研究方法, 為腸道微生物領域研究注入了一股新的活力。如趙曉偉等[13]運用MiSeq測序技術分析了紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)養殖環境菌群的多樣性; Wu等[14]運用Roche 454高通量測序的方法對異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)腸道菌群多樣性及菌群來源進行了研究。顯然,高通量技術已經成為研究腸道菌群的主流方法, 然而鮮見將大黃魚腸道菌群用于評估發酵豆粕可利用性的文獻報道。因此, 本文研究在養殖過程中發酵豆粕對大黃魚幼魚生長、腸道組織結構及腸道菌群的影響, 對于人工養殖技術的提高有著積極的意義, 可以有效地提高養殖動物的產量和養殖經濟效益。

表1 實驗飼料及營養水平(干物質基礎)Tab. 1 Composition and nutrient levels of basal diets (dry matter basis) (%)

1 材料與方法

1.1 實驗設計與實驗飼料

實驗飼料組(表1)中分別添加0 (FSM0)、15%(FSM15)、30% (FSM30)、45% (FSM45)、60%(FSM60)和75% (FSM75)發酵豆粕替代魚粉組的基礎飼料, 配制等氮等脂(蛋白水平為45%; 脂肪水平為10%)的6種實驗用配合飼料。此外, 在基礎飼料中以對照組(FSM0)的飼料賴氨酸、蛋氨酸含量為基準, 分別添加相應水平的晶體賴氨酸和蛋氨酸的五組實驗飼料, 各實驗組營養成分見表2, 其試驗飼料制作過程及方法參照馮建等[15]試驗方法。

1.2 實驗用魚和養殖過程

實驗大黃魚幼魚(10.49±0.03) g均采自浙江省象山縣西滬港區養殖場的同一批魚種, 其試驗管理參考馮建等[15]的方法進行。

1.3 樣品采集和分析

參照馮建等[15]方法對每處理3個重復組樣品進行9個樣品的采集。從每個網箱隨機取3尾體格健康的魚, 活體解剖, 取出后腸組織于甲醛溶液中固定36h, 然后轉入70%乙醇中保存, 用于后腸組織切片分析。應用Nikon ECLIPSE Ci (顯微鏡型號)對組織切片進行觀察拍照, 運用Image-Pro Plus6.0軟件測量分析腸組織的黏膜厚度, 黏膜皺褶高度, 并計數杯狀細胞的數量及絨毛數量以及使用軟件SPSS20對腸道指標進行方差分析。此外, 每個網箱隨機另取5尾體格健康的大黃魚幼魚, 于無菌操作臺上進行后腸取樣, 用75%酒精擦拭腸道外壁, 用鑷子去除附著表面的脂肪; 用磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)輕柔漂洗3次, 將腸道壁漂凈后剪碎放入滅菌50 mL EP管中, 來源于同一網箱的5個樣本混勻, 先放入液氮罐保存待帶回實驗室于–20℃保存用腸道菌群研究。

表2 實驗飼料氨基酸組成(干物質基礎)Tab. 2 Amino acid composition of the experimental diets (dry matter) (%)

1.4 Illumina-MiSeq宏基因組測序

腸道菌群總DNA的提取及PCR擴增腸道細菌總DNA的提取采用bacterial DNA Kit試劑盒(Omega, 美國), 具體步驟參照試劑盒說明。以提取的基因組DNA作為模板進行16S rRNA基因V4—V5區擴增特異區域, 其引物為515F (5′-GTGC CAGCMGCGCGG-3′)和907R (5′-CCGTCAATTCM TTTRAGTTT-3′)。PCR反應體系為(50 μL):10×PCR緩沖液5 μL, dNTPs mixture (各2.5 mmol/L)4 μL, 引物(10 mmol/L)各2 μL, 模板DNA 10 ng, ExTaq酶(TaKaRa, 大連) 1.5 U, 滅菌雙蒸水補足至50 μL。PCR反應條件: 94℃ 5min; 94℃ 1min, 55℃ 45s,72℃ 1min, 35個循環; 72℃ 10min (PCR儀為ABI Gene-Amp 9700 型)。擴增好的DNA序列, 經瓊脂糖電泳檢測陽性后交由南京集思慧遠生物科技有限公司用Illumina MiSeq (Illu-mina, 美國)高通量測序技術進行序列測定和分析。

富集并擴增DNA文庫將每一個樣品DNA等量混合后, 采用標準的Illumina Tru Seq DNA文庫制備試驗流程構建所需的宏基因組上機文庫, 并在Illumina MiSeq基因組分析平臺上進行Barcoded Illumina MiSeq測序, 采用PE2500測序策略, 每個樣品完成1個PE的文庫構建, PE library Insert size為500 bp; 每個樣品產出最低不少于2萬對reads, Clean date測序質量Q30＞75%。試驗流程為: 在3′—5′核酸外切酶及聚合酶的共同作用, 修復帶有突出末端的DNA片段, 在修復平整的DNA片段3′末端引入單堿基A, 接頭的3′末端含有單堿基T, 從而保證DNA片段和接頭能通過A和T配對連接。利用PCR選擇性地富集兩端連有接頭的DNA片段, 同時擴增DNA文庫。

1.5 數據處理及統計分析

生長數據處理

存活率(Survival) (%)=100×Nt/N0;

增重率(Weight gain rate,WGR) (%)=100×(Wt–W0)/W0;

特定生長率(Specific growth rate,SGR) (%)=100×(lnWt–lnW0)/t;

飼料系數(Feed conversion ratio,FCR)(%)=(T–S)/(Wt–W0);

攝食率(Feed intake,FI)(%)=100×dry feed intake×2/[(Wt+W0)×t]。

上述公式中W0、Wt分別表示實驗魚初始體重和終末體重;N0、Nt分別表示養殖實驗開始時網箱中魚的尾數和養殖試驗結束時網箱中魚的尾數;t表示實驗天數;T、S分別表示總飼料量和剩余飼料量。

Illumina Miseq 測序數據處理Illumina Miseq測序所得原始測序序列經去除primer并按barcode切分, 同時進行質控, 過濾掉堿基平均質量值小于20的reads; 序列長度小于200的reads。用usearch軟件對數據進行去嵌合體和聚類的操作。usearch聚類時, 先將reads按照豐度從大到小排序,通過97%相似度的標準聚類, 得到OTU (Operational Taxonomic Units)。在聚類過程中利用denovo方法去除嵌合體(Chimeras)。接下來對每個樣品的tags進行隨機抽平處理, 并在各個水平上統計每個樣品的群落組成。然后使用Qiime軟件, 做alpha多樣性指數的稀釋曲線, 分別利用物種豐富度指數(Chao1)、香農指數(Shannon)和辛普森指數(Simpson)公式計算細菌生態多樣性指數; 利用Mothur軟件制作柱狀圖、Venn圖及盒子圖以作OTU分析。

采用SPSS20.0軟件對文中所得數據進行單因素方差分析(ANOVA), 差異顯著后進行Tukey’S多重比較, 顯著性水平設為P＜0.05; 實驗結果以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 發酵豆粕替代魚粉對大黃魚幼魚生長的影響

從表3中可以看出, 各處理組大黃魚幼魚的存活率無顯著性差異(P＞0.05), 但有下降趨勢; FSM60和FSM75組特定生長率(SGR)、增重率(WGR)顯著低于FM0組(P＜0.05); 飼料系數(FCR)以FM0組最低, 顯著低于FSM60和FSM75組(P＜0.05)。

表3 FSM替代魚粉對大黃魚幼魚生長的影響Tab. 3 Effects of FSM on the growth of juvenile large yellow croaker

2.2 發酵豆粕替代魚粉對大黃魚幼魚腸道形態的影響

由表4、圖1可以看出, 各處理組腸道組織結構后腸黏膜厚度、皺襞高度、固有膜寬度和杯狀細胞個數與對照組均無顯著差異性(P＞0.05)。

2.3 發酵豆粕替代魚粉對大黃魚幼魚腸道菌群的結構分析

16S rRNA 基因測序結果分析運用usearch進行聚類劃分可操作分類單元(OTU), FSM0(TC)、FSM45(TB)和FSM75 (TW) 9個樣品共產生119個OTU。香農指數(Shannon)(圖2A)用于反映樣品中菌群多樣性指數, 本實驗9個樣品起初曲線上升比較迅速, 隨著測序的深入, 所有樣品測序所得序列的數值升高直至曲線平滑, 最后可以看到各樣品曲線趨于平坦, 可以反映出大黃魚幼魚后腸樣品中絕大多數菌種信息。通過計算在同一樣本中檢測到的隨機選擇擴增子序列的覆蓋率(Goods coverage)來評估抽樣的完整性, goods coverage (圖2B)指數反應了測序的深度, 指數越接近于1, 說明測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種, 此研究中各樣品如表5中所示各樣品覆蓋指數均在0.99, 覆蓋率水平表明此研究中各樣品中的微生物種類幾乎都被檢測到了。

細菌多樣性及相關性分析3組測序樣品的序列進行比對, 在生物分類學門的水平進行分類,共有9個門的細菌被發現。如圖3所示, 其中厚壁菌門(Firmicutes)占絕對優勢地位。在屬水平, 對微生物群落結構與不同樣品間的差異進行分析, 可以得到20個不同的屬(圖3), 其中類芽孢桿菌(Paenibacillus)占絕對優勢?；谝陨祥T、屬水平分析表明不同處理的大黃魚幼魚腸道菌群中優勢菌種類相同。

以各樣品中分布的OTU數為計算依據, 用MO-THUR軟件中的venn命令對各樣品中菌群菌種的多樣性進行分析并構建韋恩圖(圖4)。依據圖中的數據, 僅從樣品中細菌類別的多樣性角度進行定性分析, 不同處理組的大黃魚幼魚后腸腸道菌群結構具有一定的保守性。研究結果表明大黃魚幼魚后腸腸道內含物樣品的9個克隆文庫一共119個OTUs,其中59個共同OTUs, 占三者OTU總數的49.58%;TB與TC共有62個OTU, 占兩者OTU總數的52.10%;TW與TC共有71個OTU, 占兩者OTU總數的59.66%; TB與TW共有71個OTU, 占兩者OTU總數的59.66%。從大黃魚幼魚后腸腸道樣本的菌群相似性來看, 說明盡管是不同發酵豆粕替代水平的飼料其在相同養殖環境下大黃魚幼魚后腸腸道細菌群落的相似性較高, 具有一個核心的微生物菌群。

各處理在屬水平的差異本實驗中如圖5,較TW組, TB和TC組均顯著增加了類芽孢桿菌(Paenibacillus)和嗜堿菌屬(Alkaliphilus)的物種豐度(P＜0.05); 與TW組相比, TB組水棲菌屬(Enhydrobacter)和TC組副球菌屬(Paracoccus)的物種豐度均顯著降低(P＜0.05)。

表4 飼料中FSM對大黃魚幼魚腸道顯微結構指標的影響Tab. 4 The effects of FSM on intestinal microscopic structure

3 討論

3.1 發酵豆粕替代魚粉對大黃魚幼魚生長的影響

圖1 飼料中FSM對大黃魚幼魚腸道形態的影響 (后腸, 100×)Fig. 1 The effects of FSM on the intestinal morphology of juvenile large yellow croaker (posterior intestine, 100×)

圖2 大黃魚幼魚后腸樣品測序序列香農指數(A)、覆蓋率(B)稀釋曲線(相似度: 97%)Fig. 2 Shannon index (left) and good coverage (right) rarefaction curves of sequenced reads in posterior intestine of large yellow croaker(The rightsimilarity: 97%)

發酵豆粕采用微生物發酵后, 有效降低了豆粕中抗營養因子的含量[16], 使之更容易被水產動物所吸收。通過豆粕和發酵豆粕替代魚粉的對比試驗,劉興旺等[17]發現: 替代卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)相同水平的飼料魚粉, 發酵豆粕組的增重率和飼料利用率顯著高于普通豆粕替代組。Sharawy等[16]用釀酒酵母固態發酵豆粕對在印度明對蝦(Fenneropenaeus indicus)飼料配方中的魚粉進行了替代研究, 其結果顯示, 釀酒酵母固態發酵豆粕可以應用于印度明對蝦的養殖實踐, 但是隨著替代比例的增加, 印度名對蝦的SR、SGR顯著下降, 完全替代組(FS100)達到最低水平(SR為90%和SGR為4.92)。本實驗也得到了相似結果, 雖然各替代水平的大黃魚幼魚存活率并無顯著差異, 但有明顯的下降趨勢。從表4的數據中可以看到: 與對照組相比, 發酵豆粕替代45%以下水平的飼料魚粉, 其SR、SGR、WGR和FCR并無顯著差異(P＞0.05), 但超過45%的替代水平,SGR、WGR顯著低于對照組,FCR顯著高于對照組(P＜0.05), 這表明大黃魚幼魚飼料中發酵豆粕的適宜比例為45%, 超過45%則會對其生長產生不利影響, 這與牙鲆(Paralichthys olivaceus)的適宜替代比例相同[18]。而淡水的黃金鯽(Carassius auratus)對發酵豆粕表現出更強的適應性, 其替代比例可達52.5%[19]。在本實驗中, 發酵豆粕替代魚粉超過45%后, FI反常的顯著高于對照組, 原因可能是投餌時大黃魚幼魚虛假搶食, 造成誤判而過度餌料, 導致了FI的升高。

表5 樣品的多樣性指數Tab. 5 Alpha-diversity of samples

圖3 在生物分類學門、屬的水平對組測序樣品序列進行分類Fig. 3 The relative abundance of posterior intestine from large yellow croaker with different diets, by phylum and genus

3.2 發酵豆粕替代魚粉對大黃魚幼魚腸道組織結構的影響

腸道是營養物質消化吸收的重要部位, 其營養消化吸收原理與腸道黏膜具有的生化屏障和免疫屏障功能息息相關[20]。大黃魚腸道黏膜層形成許多縱行褶皺, 皺襞為消化管較大的突起, 使消化吸收面積大大增加[21]。目前魚類腸道組織的研究主要集中在組織學上, 關于發酵豆粕對魚類腸道形態結構影響的研究較少。在本試驗條件下, 大黃魚幼魚發酵豆粕各處理組黏膜厚度、皺襞高度、固有寬度和杯狀細胞個數與對照組均無顯著差異性, 這與Couto[22]、Gao[23]和Zhou等[24]研究結果類似。然而, 在Venold等[25]對投喂豆粕的虹鱒(Oncorhynchus mykiss)研究發現, 其腸道形態與對照組有顯著差異; 吳莉芳等[26]研究去皮豆粕投喂埃及胡子鲇(Clarias lazera)時發現其替代魚粉比例超過45%時腸道皺襞高度均顯著下降; 張錦繡等[27]研究去皮豆粕替代魚粉喂養幼建鯉(Cyprinus carpiovar.jian)時發現會導致其前后腸皺襞高度顯著下降。目前,普遍認為豆粕中的凝集素、抗原蛋白、大豆皂苷等會破壞魚類的消化道結構, 使腸道受傷害, 但豆粕經發酵處理后能消除大分子抗原蛋白和有效降低胰蛋白酶抑制因子[28]。程璐[29]在異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)飼料的研究中添加不同比例的發酵谷物蛋白, 其結果表明, 發酵谷物蛋白各試驗組的異育銀鯽前腸的黏膜褶高度和寬度與魚粉對照組均無顯著性差異, 其研究結果與本試驗相似。本實驗腸道形態結構未受到顯著影響, 一方面可能是因為豆粕經微生物發酵后抗營養因子減少, 減輕了腸道的過敏反應, 維持腸道結構的完整性; 另一方面, 經微生物發酵后的豆粕富含生物活性物質, 可以促進腸道內營養物質的消化吸收。

圖4 不同處理組的共同OTU分析Fig. 4 Shared OTU analysis of different groups

圖5 各處理在屬水平的差異比較Fig. 5 Comparison of effects with different treatments in the level of Genus

3.3 發酵豆粕替代魚粉對大黃魚幼魚腸道微生物的影響

水產動物的腸道中有大量的微生物, 它們在長期的歷史進化過程中形成了一個動態的復雜的微環境, 在這個微環境中, 腸道微生物是否維持穩態,直接影響著魚體的消化吸收、防御及生長發育[30]。因此, 建立健康的腸道微生物區系, 有助于提高水產動物的生產性能。本實驗采用Illumina高通量測序技術比較了不同發酵豆粕替代魚粉水平對大黃魚幼魚腸道細菌群落結構和多樣性的影響, 發現處于門和屬的分類水平上, 不同處理的大黃魚幼魚腸道菌群中優勢菌群種類相同, 其門水平上的厚壁菌門(Firmicutes)和屬水平中類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)占絕對優勢, 推測這些優勢菌群可能和其在苗種階段就已經定值的菌群相關。Michelle等[31]認為處于孵化階段的幼魚, 其所需營養物質來源于卵黃, 當其孵化出來, 由于其消化道發育不全, 消化道內處于無菌狀態, 當其接觸到水生環境及餌料時,多種細菌就會進入到腸道, 最初進入到腸道的微生物適應環境后定植于腸道上皮, 維持動態平衡, 與魚體形成互利共生關系且在生長過程中優勢菌群并不會隨環境和其他因素發生明顯的變化。通過ven圖分析發現在相同養殖環境下, 不同發酵豆粕替代水平飼料對大黃魚幼魚后腸腸道細菌群落的相似性影響不大, 具有一個核心的微生物菌群。這與Wong等[32]研究了不同飼料組分下虹鱒魚的腸道微生物具有一個核心的微生物菌群結果類似。

類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)源于芽孢桿菌屬(Bacillus), 是一類重要的防治病害的微生物, 其能產生抗菌蛋白質或酶等抗菌物質誘導宿主的抗病能力[33]。水棲菌屬(Enhydrobacter)是γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)的弧菌科, 弧菌是海水養殖動物的主要病原菌之一。副球菌屬(Paracoccus)其為球形, 呈單個、成對或堆存在, 是a-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的紅桿菌科(Rhodobacteraceae)其為兼性厭氧菌[34]。本試驗結果表明, 使用高替代量的發酵豆粕后, 大黃魚幼魚腸內類芽孢桿菌豐度TW組顯著低于TC和TB組, 而水棲菌屬(Enhydrobacter)物種豐度TB組顯著低于TW組, 副球菌屬(Paracoccus)物種豐度TC組顯著低于TW組, 這可能與發酵豆粕營養特性有關。有研究表明, 發酵豆粕中含有大量有益微生物(如乳酸菌)及具有類抗生素作用的代謝物, 適量的替代量在一定程度上能有效抑制腸道有害菌的增殖[35]。然而豆粕經過發酵工藝后, 由于抗營養因子在發酵過程中因鈍化機理、加工程度不同導致其消除程度有所差異[36], 使得高發酵豆粕替代組受某些抗營養因子(如大豆球蛋白等)的影響, 打破腸道菌群的穩態, 阻礙益生菌的生長, 使得變形菌門(Proteobacteria)物種豐度增加[37],這與張振男等[38]研究的攝食高蠶豆組的草魚腸道中有益菌物種豐度減少, 條件致病菌物種豐度增多結果類似。推測攝食高發酵豆粕組大黃魚腸道菌群生態系統穩態遭到破壞, 可能會引發腸道感染,從而影響到魚體生長。

4 總結

本實驗用發酵豆粕對大黃魚幼魚飼料魚粉進行替代研究, 發現FSM替代45%的魚粉不會影響其生長、腸道組織結構及優勢菌群變化, 但是隨著替代水平的進一步升高, 存活率、特定生長率下降,因此, 在本實驗條件下, FSM替代飼料(含40%魚粉)45%的魚粉較為適宜。