眼斑擬石首魚虹彩病毒病的診斷

席云清 戚瑞榮 田佳鑫 張會軍 雷 燕 唐紹林 王桂芹

(1. 吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118; 2. 廣州利洋水產科技股份有限公司，廣州 510515;3. 廣州金水動物保健品有限公司，廣東 510515)

虹彩病毒科(Iridovirus)病毒是雙鏈DNA病毒,病毒粒子為正二十面體。該病毒科包括5個病毒屬,其中3個屬: 細胞腫大屬虹彩病毒(Megalocytivirus)、蛙病毒屬(Ranavirus)、淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)主要感染魚類、兩棲類等低等脊椎動物[1]。細胞腫大病毒相對來說是一個新的家庭成員, 目前已被分離鑒定的種類繁多, 其中傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)已被我國農業部公告第1125號列為二類動物疫病, OIE將同病毒屬的真鯛虹彩病毒(Red sea bream iridovirus, RSIV)列為必須申報的疾病。該屬病毒具有廣泛的宿主范圍, 嚴重影響了包括真鯛(Pagrus major)、條石鯛(Oplegnathus fasciatus)、鱖(Siniperca chuatsi)、石斑魚(Epinephelussp)、云斑尖塘鱧(Oxyeleotris marmoratus)、大口黑鱸(Micropterus salmoides)在內的眾多養殖魚類[2—7]。并且該屬病毒可導致高死亡率, 給養殖產業造成重大的經濟損失。因此已成為目前感染魚類的重要病原之一。

眼斑擬石首魚(Sciaenop socellatus)又稱美國紅魚、紅擬石首魚、紅鼓魚、黑斑紅鱸、斑點尾鱸等, 屬鱸形目, 石首魚科, 擬石首魚屬[8], 該魚原產于美國東南海岸, 我國臺灣和青島分別于1987年和1991年引進此魚, 目前已在我國南方及北方部分地區大面積養殖[9]。該魚肉質鮮美, 口感和觀感俱佳,且具有生長快、病害少, 廣溫、廣鹽等優點, 早在美國成為重要的養殖種類, 現如今已成為世界上養殖產量很高的海水養殖種類之一。2010—2017年,廣東省珠海市池塘養殖的眼斑擬石首魚每年大約在6—10月期間開始陸續大面積發病, 病魚主要癥狀為體色變為銀黑色, 鰭基出血, 鰓絲貧血并有出血點、脾臟腫大。內服各種抗菌藥物治療無效, 外用刺激大的消毒、殺蟲藥物治療后死亡數劇增, 嚴重時死亡率高達90%, 給養殖業者造成了很大的經濟損失。

本文通過流行病學調查、癥狀觀察, 結合病原學檢測、病理學以及分子生物學診斷技術, 分析廣東省珠海市眼斑擬石首魚養殖池塘發病的原因, 確定眼斑擬石首魚發病的病原。

1 材料與方法

1.1 材料

患病魚取自廣東省珠海市典型眼斑擬石首魚發病養殖池塘, 共取20尾發病瀕死魚, 并取10尾健康魚作對照。

95%酒精, 100%酒精, 波恩氏液, 2×Taq PCR Master Mix, 2216E、腦心浸液瓊脂(BHI)和普通培養基(TSA)購自青島海博生物技術有限公司。

1.2 方法

流行病學調查和癥狀觀察調查發病魚的魚齡、苗種來源、池塘發病率、池魚死亡率和傳染性; 發病水溫等水質理化、生物指標和發病前后天氣變化、水質變化情況; 發病前后的給藥、投喂等與發病有關的池塘管理情況。取發病魚, 置于解剖盤中, 首先觀察體表有無異常、寄生蟲等, 再解剖觀察各內臟組織器官的病變情況, 并做記錄。

寄生蟲檢查主要檢查病魚的鰓絲、血液和內臟器官, 參照文獻[10]中的方法, 取少許鰓絲置于載玻片上制作水浸片, 于光學顯微鏡下觀察有無寄生蟲。推片法制作血涂片, 于光學顯微鏡下觀察有無寄生蟲。肝臟、脾臟、腎臟和腸道采用壓片法, 于光學顯微鏡下觀察有無寄生蟲。

細菌分離鑒定用70%酒精棉球擦拭魚體,在無菌條件下, 以平板劃線法從患病魚的肝、脾、腎、腦等處分離細菌, 分別接種于營養瓊脂培養基,倒置于28℃恒溫培養箱中培養24h, 觀察細菌的生長情況。

組織病理學觀察分別取病魚的鰓絲、肝臟、脾臟、腎臟和腸道等組織, 用波恩氏液固定24h, 用70%酒精換液, 之后每隔4h換液一次, 直至溶液無黃色, 之后用梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟浸蠟包埋成塊、于石蠟切片機上切成5 μm蠟帶, 蘇木精-伊紅(HE)染色后, 于光學顯微鏡下觀察并拍照。

PCR檢測檢測引物使用OIE推薦的檢測虹彩病毒的特異性引物[11], 上下游引物序列為: P1: 5′-CTCAAACACTCTGGCTCATC-3′, P2: 5′-GCAC CAACACATCTCCTATC-3′。預擴增片段長度為570 bp, 引物由上海英俊生物技術有限公司合成。分別取肝、脾、腎、腸、鰓等組織器官, 研磨后在–20℃下反復凍融4次, 然后用酚-氯仿法提取組織DNA, 放置在–20℃下保存備用。

采用引物P1和P2, 配制20 μL反應體系進行PCR反應: 無菌蒸餾水6 μL, 2×Taq PCR Master Mix 10 μL, 上下游引物各0.5 μL, DNA模板3 μL。PCR反應程序: 95℃下預變性5min; 95℃下變性30s,55℃下退火30s, 72℃下延伸30s, 共進行30個循環;最后在72℃下再延伸10min, 放置在4℃下保存。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

對PCR擴增后的產物進行回收, 送往上海美吉生物醫藥科技有限公司廣州分公司對回收基因片段進行克隆測序。將測序結果在NCBI blast上進行片段基因相似性檢索。

主衣殼蛋白序列的測定和分析參照文獻[12]中的方法, 比對并合成MCP全長擴增引物, 引物序列為: MCP-F:5′-GGATCCATGTCTGCAATCTCA GGTGCAAACGTAA-3′, MCP-R:5′-CTCGAGCA GGATAGGGAAGCCTGCGGCG-3′。

采用引物MCP-F和MCP-R擴增MCP全長序列,大小約為1300 bp, 下劃線標注分別是BamHⅠ和xhoⅠ酶切位點, 能保護PCR產物得完整性, 將PCR擴增產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳, 并將純化的產物送上海美吉生物醫藥科技有限公司廣州分公司進行測序。應用DNAstar v7.1分析軟件對測序基因序列與NCBI中下載的虹彩病毒代表株進行核苷酸序列同源性分析, 構建系統發育樹。

2 結果

2.1 流行情況及癥狀觀察

該病在該養殖地區內主要發生于水溫在20—30℃的5—10月, 水溫25—28℃為發病高峰。發病魚規格全長一般在10 cm以上。在正常情況下死亡率較低, 約5%—30%, 當有藥物刺激或投喂量大、水質劇烈變化等其他應激因素時日死亡量迅速增加, 有些發病池塘最后累計死亡率可達90%。多數池塘是在適宜水溫范圍內受到強烈應激后池魚發病或注入未經處理的河道水后發病。

發病后病魚上浮、在水面下停滯或漫游; 體型消瘦、體色變為銀黑色、兩眼間皮膚褪色、顏色淡紅, 尾鰭基部出血。病魚鰓絲貧血有出血點。解剖見脾臟腫大, 肝臟貧血發白, 腎臟腫大(圖1)。在鰓、肝、脾、腎、腸等組織或器官中未發現大量寄生蟲。

2.2 細菌培養結果

將30尾眼斑擬石首魚的肝、脾、腎臟分別接種于普通培養基, 恒溫培養24h后均未見優勢菌生長。

2.3 組織病理變化

組織切片顯示, 患病眼斑擬石首魚的肝、脾、腎、腸組織均發生了不同程度的病變, 且在肝、脾、腎、腸組織中均可見感染虹彩病毒后的特征性病變-直徑約為20—30 μm形態異常的嗜堿性腫大細胞(圖2)。

健康魚肝細胞為多邊形, 排列均勻有規則(圖2A)?；疾◆~肝組織輕度脂肪變性, 輕微淤血, 肝細胞界限不明, 可見零星腫大細胞(圖2B)。

健康魚脾實質細胞主要由大量的淋巴細胞、紅血細胞及其數量不等的單核細胞等組成(圖2C)?；疾◆~脾組織中可見多個腫大細胞, 脾實質細胞散在壞死, 細胞核固縮, 散布少量黑色素巨噬細胞中心(圖2D)。

健康魚腎由泌尿組織和淋巴組織構成, 泌尿組織部分可見腎小球和腎小管, 腎小管上皮細胞為立方狀或長方狀, 細胞核位于細胞中部(圖2E)?；疾◆~的腎間組織細胞散在有壞死, 且可見多個腫大細胞(圖2F)。

健康魚腸組織結構一般有4層: 黏膜層、固有層、肌層和漿膜層, 組織輕微淤血(圖2G)?；疾◆~腸固有層可見腫大細胞, 且有少量淋巴細胞浸潤(圖2H)。

圖1 病魚解剖特征Fig. 1 Characteristics of diseased fish

2.4 瓊脂糖凝膠電泳結果

分別以發病魚和健康魚組織DNA作為模板, 采用特異性引物P1和P2通過PCR方法進行檢測, 發病魚可以擴增出570 bp左右的特異性條帶, 與預期大小符合, 而健康魚無任何擴增條帶。

2.5 MCP序列分析

將測得的核苷酸序列在NCBI中進行比對, 結果表明與已報道的細胞腫大屬的真鯛虹彩病毒(RSIV)同源性最高約為99.2%, 與斜帶石斑魚虹彩病毒(OSGIV)同源性為97.9%, 與傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)同源性為93.5%。另外從GenBank中查找虹彩病毒MCP相關序列, 包括蛙病毒屬(Ranavirus)代表株: 蛙病毒(FV3)、虎紋蛙病毒(TFV); 淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)代表株:淋巴囊腫病病毒中國株(LCDV-C)、淋巴囊腫病病毒1型(LCDV-1)。分析了MCP基因測序結果, 其核苷酸序列遺傳進化分析結果見圖3。結果表明: 測序得到的MCP序列(S. ocellatusIridovirus, SOIV, 暫未提交NCBI)與細胞腫大屬虹彩病毒聚為一簇。所以判定從眼斑擬石首魚檢測到的病毒應為細胞腫大屬虹彩病毒。

3 討論

本研究通過流行病學調查、癥狀觀察、細菌學診斷、病理學診斷以及分子生物學診斷, 確定引起廣東珠海地區池塘養殖眼斑擬石首魚并大量死亡的病因是感染了細胞腫大病毒屬虹彩病毒。目前細胞腫大屬虹彩病毒在其他種屬魚類中已有大量報道, 但在眼斑擬石首魚中屬首次報道。

圖2 眼斑擬石首魚組織病變情況Fig. 2 The pathological changes of the tissue of Sciaenops ocellatus

目前報道眼斑擬石首魚感染較多的疾病是細菌性疾病, 如海藻希瓦氏菌、海豚鏈球菌、哈維氏弧菌、燦爛弧菌等[13—16], 感染細菌的癥狀基本上表現為皮膚潰瘍或腐爛、爛鰓、肝臟糜爛; 此外渦蟲感染的寄生蟲病也有相關報道[17], 而感染渦蟲的癥狀主要是爛鰓、鰓絲分泌大量黏液及增生組織將其包裹。本研究中發病眼斑擬石首魚的癥狀主要表現為體色發黑、鰓絲貧血和肝脾腎臟器腫大, 這與以上研究者報道的細菌和渦蟲感染的癥狀有明顯區別, 但與李凱彬等[18]報道的網箱養殖眼斑擬石首魚感染虹彩病毒的癥狀有類似之處, 如體色變深、鰓絲發白貧血。流行病學調查發現病魚有消毒、殺蟲藥物刺激或其他應激因素時日死亡量迅速增加, 這與病毒病的流行特點相同, 并且通過對發病眼斑擬石首魚細菌分離培養與解剖鏡檢排除細菌、寄生蟲感染的可能。通過對病魚的組織病理觀察發現其變化與真鯛虹彩病毒、鱖傳染性脾腎壞死病毒和云斑尖塘鱧虹彩病毒報道的情況相似[2,4,12], 可在多個器官組織病理切片中發現有細胞腫大屬虹彩病毒的特征性病變即嗜堿性的腫大細胞, 從而說明該病毒為細胞腫大屬虹彩病毒的可能性。

圖3 虹彩病毒的系統發育樹Fig. 3 The phylogenetic tree of Iridovirus

為了驗證引起該病的病原本實驗進一步從分子水平展開研究。本實驗根據OIE推薦的檢測虹彩病毒的特異性引物[11]對病魚進行病毒檢測, 結果在病魚組織中擴增出570 bp大小的特異性條帶, 從而證實發病魚體內虹彩病毒的存在。同時通過高度保守的虹彩病毒MCP基因序列構建系統發育樹, 可以明確證實該病毒與細胞腫大屬虹彩病毒親緣關系最近, 由此說明引起該病的病原為細胞腫大屬虹彩病毒且與真鯛虹彩病毒同源性較高, 同時這對眼斑擬石首魚池塘養殖過程中感染的虹彩病毒的分類地位做出比較確切的研究。

在本次對疾病的診斷過程中通過調查發現當水溫為20—30℃的5—10月該病易發, 且在25—28℃時達到發病高峰。并且當魚規格全長一般在10 cm以上時易發該病, 因此在該段時期應加強對該病的監測力度, 當發現養殖魚群開始發病時建議從事漁業管理人員應首先從發病魚的癥狀和流行情況上對該疾病做出相應的診斷, 及時做好初步的補救措施, 如停止喂料, 停止換水等應激操作,以期為減少發病后續的死亡量。